肝癌耐藥細胞中MDR1 mRNA、P-糖蛋白的表達變化及意義

段 睿，張 浩

(荊門市第一人民醫院，湖北荊門448000)

化療是中晚期肝癌的主要治療手段，但治療效果不理想，與腫瘤的多藥耐藥(MDR)密切相關。研究顯示，肝癌細胞中MDR1基因的擴增及其產物P-糖蛋白的過度表達，是導致化療失敗的重要原因。2009年5月～2010年11月，我們用不同濃度鹽酸阿霉素(Adr)誘導肝癌耐藥細胞株HepG2(HepG2 Adr)，觀察HepG2、HepG2 Adr細胞中 MDR1基因、P-糖蛋白表達的變化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 肝癌 HepG2細胞，RPMI1640，胎牛血清，Adr;RT-PCR兩步法試劑盒，免疫組化SP試劑盒，兔抗人P-糖蛋白單克隆抗體，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 耐藥肝癌細胞株的建立 采用藥物濃度遞增法，誘導產生對 Adr具有穩定耐藥性的HepG2Adr，Adr濃度梯度為 0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L，在含20%FCS的RPMI1640培養液中傳代培養。

1.2.2 HepG2、HepG2 Adr細胞中 MDR1 mRNA 檢測方法 取對數生長期的HepG2及不同Adr濃度梯度下的HepG2 Adr細胞，按RT-PCR兩步法試劑盒說明操作。以β-actin作為內參照，以其比值作為MDR1 mRNA表達量。其中β-actin上游引物為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游引物為5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'，片段大小為303 bp;MDR1上游引物為5'-CCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物為 5'-AGTCCTCGTCTTCAAACTTG-3'，片段大小為157 bp。

1.2.3 HepG2、HepG2 Adr細胞中 P-糖蛋白檢測方法 采用免疫組化SP法。取對數生長期的HepG2及不同Adr濃度梯度下的HepG2 Adr細胞，細胞爬片后經多聚甲醛固定，加入1∶400兔抗人P-糖蛋白單克隆抗體，按劑盒說明染色。P-糖蛋白陽性細胞為腫瘤細胞膜和(或)細胞質出現棕黃色顆粒。每組隨機觀察10個高倍視野，計算P-糖蛋白陽性細胞所占百分比，以此表示P-糖蛋白表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HepG2、HepG2 Adr細胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表達比較，見表1。由表1可見，肝癌HepG2 Adr細胞與 HepG2細胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表達量比較，P均＜0.05;且隨著肝癌HepG2 Adr細胞耐藥性增高，MDR1 mRNA、P-糖蛋白表達量逐漸增高(P 均 ＜0.05)。

3 討論

MDR是指抗某種細胞毒物的耐藥細胞系對許多結構上無關、作用機制不同的其他抗癌藥物產生交叉抗藥性［1］，是化療失敗最常見原因之一。目前，研究顯示肝癌MDR的分子機制包括:① MDR1途徑;②多藥耐藥相關基因(MRP)和肺癌多藥耐藥基因(LRP)途徑;③抗細胞凋亡信號增強途徑;④谷胱甘肽酶系統激活途徑;⑤改變DNA拓撲異構酶途徑;⑥乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)介導途徑［2］。由此可見，肝癌MDR是多因素、多水平、多基因參與的一個極其復雜過程。

表1 HepG2、HepG2 Adr細胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表達量比較(± s)

表1 HepG2、HepG2 Adr細胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表達量比較(± s)

肝癌細胞類型 MDR1 mRNA P-糖蛋白(%)HepG2 0.18±0.08 5.73± 0.52 HepG2 Adr 0.01 μmol/L Adr 0.26±0.11 15.44± 4.55 0.10 μmol/L Adr 0.56±0.17 26.76± 5.23 1.00 μmol/L Adr 10.78±0.20 64.21±14.22 10.00 μmol/L Adr 1.21±0.17 90.23± 7.68

目前，研究最多且得到大家廣泛認可的是MDR1途徑。與P糖蛋白有關的基因有3種，即MDR1、MDR2和 MDR3，其中 MDR1基因與腫瘤細胞耐藥性有關［3］。由MDR1編碼并翻譯的P-糖蛋白，是具有三磷酸腺苷(ATP)結合域的跨膜轉運蛋白超家族成員。當其與化療藥物結合后，可依靠ATP提供的能量將多種結構和作用機制不同的化療藥物排出腫瘤細胞外，導致細胞內化療藥物濃度明顯下降，從而阻礙化療藥物在細胞內發揮作用，不能有效殺傷腫瘤細胞而產生腫瘤細胞耐藥現象［4，5］。本研究以人肝癌細胞為研究對象，在體外經Adr多次篩選、傳代建立肝癌細胞耐藥模型HepG2 Adr，研究肝癌耐藥細胞MDR1 mRNA和P-糖蛋白的變化。結果表明，肝癌耐藥細胞HepG2 Adr的MDR1 mRNA和P-糖蛋白表達明顯增加，且其表達量與腫瘤細胞耐藥的程度呈正相關。這說明MDR1 mRNA及P-糖蛋白升高是肝癌MDR產生的重要途徑，其可將肝癌細胞內化療藥物泵出胞外，使細胞內藥量降低而無法有效殺滅腫瘤細胞。因此，在臨床診治過程中，我們可以通過對肝癌組織或細胞進行MDR1 mRNA及P-糖蛋白檢測，對于高表達者盡量避免使用屬于MDR的藥物或采用其他治療方法，進行個體化治療，以獲得更好的治療效果。

［1］魏若晶，賈寧，楊文增，等.膀胱癌組織中 MDR基因產物 PGP170的表達及意義［J］.軍醫進修學院學報，2009，2(30):41.

［2］蔣明東，李少林.肝癌MDR產生途徑與逆轉研究進展［J］.天津醫藥，2006，5(34):353-354.

［3］徐彬.卵巢上皮性癌中GST-π、TopoⅡβ、MDR1的表達及其與化療療效的關系［J］.現代實用醫學，2011，2(23)128-133.

［4］Salvesen GS，Duckelt CS.IAP proteins:Blocking the road to death＇s door［J］.Nal Rev Mol Cell Biol，2002，3(6):401-410.

［5］惠廷平，黃高升.膀胱移行細胞癌P-gp 170表達與細胞凋亡的關系［J］.第四軍醫大學學報，2002，23(10):947-949.