艾迪注射液對大腸癌細胞的生長抑制作用觀察及相關機制探討

張俊華，張銀旭，左 騰，王亞華

(1遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121001;2遼寧省興城市核工業部246醫院)

臨床應用發現，艾迪注射液是有確切療效的抗癌制劑，但其作用機制仍不十分明確。從中醫學的角度來說，瘀血內阻是發生惡性腫瘤的重要病機。2011年3～9月，我們觀察了艾迪注射液對大腸癌SW620細胞的生長抑制作用，并通過誘導人單核白血病細胞(THP-1)分化成為M2型巨噬細胞(M2φ)建立模擬腫瘤的微環境，觀察大腸癌SW620細胞的上皮—間質轉化情況，以探討艾迪注射液抗腫瘤的相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人單核白血病細胞(THP-1)，SW620細胞。佛波酯，IL-4，RPMI1640培養液，胎牛血清，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，胰酶及噻唑藍(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)。艾迪注射液。TranswellTM培養板，CD68及 CD163流式抗體，E-鈣黏素(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)。蛋白免疫印跡相關抗體及ELISA試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 艾迪注射液對SW620細胞的抑制作用觀察

采用MTT實驗。選對數生長期的SW620細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，貼壁后棄去培養液，分別加入終濃度為 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液100 μl(實驗組)，以不加艾迪注射液、正常培養的SW620細胞作對照(對照組)。兩組培養3 d后棄去上清，各加入100 μl的MTT試劑，繼續培養4 h后取出，加入DMSO顯色后測各組光密度值(OD值)。實驗組SW620細胞生長抑制率=(OD對照組－OD實驗組)/OD對照組×100%。

1.2.2 模擬腫瘤微環境的建立 將THP-1細胞置于含10%胎牛血清、2 g/L碳酸氫鈉、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及20 mmol/L HEPES的RPMI 1640培養基中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養，3 d傳代1次。取對數生長期THP-1細胞按2.5×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入含200 nmol/L佛波酯的培養液4 ml，培養3 d。用PBS充分洗滌3次，去除不貼壁和死亡細胞。每孔加入含10 ng/ml的 IL-4 10 ng/ml培養液24 h，流式細胞儀檢測其表面CD68、CD163抗原為陽性，證明THP-1已被誘導分化成M2φ。收集M2φ，接種于TranswellTM培養板的上層小室里，即為體外腫瘤微環境模型。

1.2.3 艾迪注射液對模擬腫瘤微環境中細胞培養上清液 TNF-α、TGF-β 及 SW620 細胞 E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 將相同數目對數生長期的SW620接種于上述Transwell培養板下層小室，分別加入終濃度為20、60、100 mg/ml的艾迪注射液作為實驗組，以不加艾迪注射液、單獨培養的SW620細胞以及不加艾迪注射液、接種于上述TranswellTM培養板下層小室的SW620細胞作對照(分別為對照1、2組)。于 24、48、72 h 收集各組培養上清液，用ELISA法測TNF-α、TGF-β;收集各組模型底層小室里的 SW620細胞，用 Western blot法測細胞中的E-cadherin、Vimentin蛋白(以目的蛋白灰度值與βactin灰度值的比值表示)。

1.3 統計學方法 采用SPSS14.0統計軟件。數據比較用t檢驗、方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 艾迪注射液對SW620細胞的抑制作用 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液對 SW620 細胞的生長抑制率分別為37.35%±3.47%、45.91%±4.59%、76.39%± 2.33%、81.55%± 1.84% 及83.27%±1.56%，隨艾迪注射液濃度的增加，細胞的生長抑制率逐漸上升(P均＜0.05)。

2.2 各組細胞培養液中TNF-α、TGF-β的表達比較見表1。

2.3 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較 見表2。

3 討論

表1 各組細胞培養液中 TNF-α、TGF-β的表達比較(ng/ml，±s)

表1 各組細胞培養液中 TNF-α、TGF-β的表達比較(ng/ml，±s)

注:與對照1 組相比，*P ＜0.05;與對照2組相比，△P ＜0.05;與同組前一時間點相比，#P ＜0.05

組別 TNF-α TGF-β 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h實驗組20 mg/ml 35.23±0.92＊△ 0.35±2.46*#△ 14.97±1.92*#△ 2.34±0.22＊△ 3.45±0.30*#△ 4.46±0.39*#△60 mg/ml 11.63±1.72＊△ 11.63±1.72＊△ 7.38±2.33*#△ 0.89±0.31＊△ 0.67±0.27*#△ 0.56±0.44*#△100 mg/ml 0.75±0.27＊△ 0.39±0.93＊△# 0.66±0.53＊△ 0.73±0.26＊△ 0.57±0.38*#△ 0.67±0.40＊△對照1 組 36.35±0.45 37.66±0.36#△ 39.32±0.32#△ 3.37±0.21 4.35±0.31#△ 5.46±0.19#△對照2 組 38.24±0.31* 39.88±0.42*# 40.37±0.54*# 4.13±0.32* 5.07±0.41*# 6.67±0.39*#

表2 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較(±s)

表2 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較(±s)

注:與對照1 組相比，*P ＜0.05;與對照2組相比，△P ＜0.05;與同組前一時間點相比，#P ＜0.05

組別E-cadherin Vimentin 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h實驗組20 mg/ml 0.42±0.01＊△ 0.36±0.02*#△ 0.24±0.13*#△ 0.32±0.03＊△ 0.37±0.13*#△ 0.56±0.19*#△60 mg/ml 0.36±0.10＊△ 0.38±0.03*#△ 0.39±0.10＊△ 0.12±0.05＊△ 0.20±0.03*#△ 0.37±0.02*#△100 mg/ml 0.25±0.11＊△ 0.36±0.14*#△ 0.46±0.18*#△ 0.10±0.03＊△ 0.06±0.03*#△ 0.01±0.01*#△對照1 組 0.98±0.32△ 0.98±0.29△ 0.97±0.30△ 0.01±0.01 0.01±0.01△ 0.01±0.01△對照2 組 0.78±0.20* 0.43±0.24*# 0.22±0.23*# 0.33±0.04 0.48±0.07*# 0.89±0.10*#

艾迪注射液的主要成分是人參、黃芪、刺五加、斑蝥的提取物，在臨床中廣泛用于治療原發性肝癌、肺癌、腸癌、等多種腫瘤。本研究結果顯示，艾迪注射液抑制了大腸癌SW620細胞的生長，其抑制率隨著藥物濃度的增加而上升。

腫瘤微環境中的各種細胞，如腫瘤相關巨噬細胞、肥大細胞、癌癥相關成纖維細胞、表達TIE-2的單核細胞、中性粒、淋巴細胞以及樹突狀細胞等都起到各種促進或抑制腫瘤發展和轉移的作用［1］。其中M2φ的作用較為突出，且與上皮—間質轉化的發生有關。TNF-α是一種有廣泛作用的細胞因子，它能造成一些腫瘤細胞系的壞死，但通過Snail途徑也能誘導細胞發生增殖與分化［2］。不少學者的研究證實TGF-β的高表達能促進上皮—間質轉化的發生［3～5］。

E-cadherin是鈣黏素超家族中的一員，它的表達降低會造成組織細胞間的黏附力下降，且增加細胞的活動能力，使其能穿過基底膜，侵犯周圍組織，造成腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移［6］。Vimentin是間質細胞表達的一種Ⅲ型中間絲，是間質細胞骨架的重要組成部分，在保持細胞完整性方面發回重要作用，常用作間質細胞的標記物［7］。本研究發現，在模擬腫瘤位環境中，不加入艾迪注射液時，培養上清液中 TNF-α、TGF-β 表達增加，E-cadherin的表達減少，Vimentin的表達增加，證實M2φ在和SW620共培養時促進了SW620細胞的上皮—間質轉化，從而使其具有遠端轉移的能力。另外，在模擬腫瘤位環境中加入艾迪注射液后，隨著藥物濃度增加及培養時間的延長，細胞培養液中TNF-α和TGF-β的表達逐漸降低，說明艾迪注射液降低了這兩種物質的表達，抑制了SW620細胞的增殖以及上皮—間質轉化;同時隨著艾迪注射液濃度增加及培養時間的延長，SW620細胞的E-cadherin表達逐漸增加而Vimentin的表達逐漸恢復未加藥時的低水平。由此認為艾迪注射液的干預逆轉了大腸癌SW620上皮細胞向間質細胞的轉化。

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［7］Otsuki S，Inokuchi M，Enjoji M，et al.Vimentin expression is associated with decreased survival in gastric cancer［J］.Oncol Rep，2011，25(5):1235-1242.