冬蟲夏草對DN大鼠腎足細胞的保護作用觀察

潘夢舒，郝 麗，鄭 云，丁 楠

(安徽醫科大學第二附屬醫院，合肥230601)

有研究表明［1］，DN無論臨床表現為微量蛋白尿還是大量蛋白尿，均伴有足細胞數目及密度減少、足細胞的寬度增加;且足細胞數目及密度減少與尿蛋白呈負相關，足細胞減少嚴重者腎小球硬化及血清肌酐水平升高的發生率均明顯增高。足細胞及其裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin在腎臟正常生理功能以及DN的發生發展中起重要作用［2～6］。多項研究結果表明［7，8］，冬蟲夏草(CS)及其制劑通過降血糖、血壓和調節血脂、減少腎細胞凋亡、拮抗腎組織纖維化等機制對發揮治療DN的作用，但其保護腎臟的機制是否與其改善DN足細胞病變有關，目前尚無確切資料證實。2009年，我們通過建立DN大鼠模型，觀察CS對DN大鼠腎足細胞的保護作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 雄性SD大鼠60只，18～20周齡，重180～200 g。人工CS菌粉(江西濟民有限制藥公司提供)。鏈尿佐菌素(STZ)，臨用前溶解在0.01 M枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5。兔抗大鼠Nephrin單克隆抗體、兔抗大鼠Podocin多克隆抗體。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及建模 所有動物適應性喂養1周后隨機分為3組，各20只。A組為正常對照組，B組為DN模型組;C組為CS干預組。B、C組根據中外文獻結合預實驗，選擇一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，以隨機血糖為≥16.7 mmol/L，尿糖 +++～++++視為糖尿病模型制作成功，4周后監測24 h，尿蛋白定量在30 mg/24 h以上者，表示DN模型成功［9］。

1.2.2 給藥方法 DN模型成功后入組干預。C組給予CS菌粉5 g/(kg·d)灌胃(水泡后溫火熬成濃度為2 g/ml)。A、B組給予等量飲用水灌胃，1次/d。每周稱重調整用藥劑量，連續給藥8周。所有大鼠在實驗期間標準飲食，自由飲水，不用胰島素。

1.2.3 觀察指標及方法 ①24 h尿白蛋白排泄量(UAER)測定:實驗結束前1 d留取大鼠24 h尿液，離心后保存于－80℃冰箱中，根據試劑盒說明書測定UAER。②腎小球、腎小管形態學檢查:大鼠處死前稱重，在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側頸總動脈插管注入4℃預冷NS，反復灌洗腎臟后游離。經腎門冠狀面切取厚約2 mm的標本，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，厚2 μm切片，行HE染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管改變。③足細胞形態學檢查:取1 mm3的腎組織，戊二醇固定，行透射電鏡檢查，觀察足細胞變化。④腎組織中Nephrin和Podocin染色方法:取8 mm3的腎組織，4%多聚甲醛固定，厚3 μm切片，行免疫熒光染色，觀察Nephrin和Podocin分布并拍照。采用JD-801D計算機圖像分析系統計算各組腎小球內Nephrin和Podocin的平均光密度。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0軟件包進行統計分析。所有數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組24 h UAER比較 A、B、C組24 h UAER分別為(36.92±3.48)、(108.06±15.73)、(65.40±8.95)mg/24 h，B 組 ＞C 組 ＞A 組(P 均 ＜0.01)。

2.2 各組腎組織病理改變 HE染色結果:A組為正常腎組織;B組腎小球肥大，腎小管變形;C組上述病理改變(腎小球肥大，腎小管變形)明顯減輕。

2.3 各組足細胞形態學變化 A組足細胞未見病理改變;B組足細胞足突融合，足突裂孔數減少、裂孔膜消失;C組足細胞損傷較B組明顯減輕，足細胞形態基本恢復正常。

2.4 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白分布情況 見表1。免疫熒光圖片及半定量分析顯示足細胞裂孔蛋白Nephrin和Podocin在A組沿腎小球毛細血管袢呈均勻連續的線狀分布;B組為彌散的顆粒狀分布，Nephrin和Podocin蛋白表達明顯減少(P＜0.01);C組與B組比較Nephrin和Podocin蛋白表達有明顯增加(P＜0.01)，表現為連續的線狀分布。

表1 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白光密度比較(±s)

表1 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白光密度比較(±s)

注:與A組比較，*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01;與 B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 Nephine蛋白 Podocin 蛋白A組0.215±0.001 0.216±0.001 B 組 0.728±0.222＊＊ 0.773±0.231＊＊C 組 0.468±0.021＊△△ 0.477±0.019＊△△

3 討論

CS為麥角菌科真菌，富含氨基酸、多糖、有機酸、多種微量元素、核苷酸、肽類及甾醇類等成分［10，11］，可通過多靶點、多環節機制，發揮減少尿蛋白、改善腎功能及減輕腎臟病理改變等作用［7，8，12］。

DN為糖尿病主要的微血管并發癥，其主要表現為尿蛋白排泄率增加、腎功能的進行性減退直至發展為終末期腎病。蛋白尿不僅是DN腎小球損傷的標志，而且是加速腎臟損害的重要原因。在本實驗中，我們發現CS可減少DN大鼠24 h UAER，減輕腎臟損害。

DN的發生與足細胞損傷有關［2～6］。足細胞是一組高度分化和特異化的細胞，通過稀疏的足突附著于腎小球基底膜，具有防止蛋白漏出、維持腎小球毛細血管袢完整性、對抗腎小球毛細血管內流體壓力和維持腎小球基底膜結構成分更新等功能。有研究表明［13，14］，DN 早期足細胞數目和密度已開始減少，隨病變加重而加重，足細胞病變不僅導致大量蛋白尿發生，且與K-W結節形成、腎小球硬化和腎功能損傷有關。足細胞相鄰足突間裂隙由裂孔隔膜連接，該膜上分布多種蛋白，主要包括Nphrin、Podocin蛋白等，又稱裂孔膜蛋白。近年研究發現，DN大鼠隨著腎臟損害的進展，其Nephrin蛋白的表達顯著降低，且與UAER增加有關。且發現DN時Nephrin呈顆粒狀分布，而在正常腎組織中呈斑點和(或)線狀分布。

我們發現，DN模型大鼠經CS治療12周后，24 h UAER顯著減少，腎小球肥大、腎小管變形明顯減輕，足細胞的足突融合、裂孔隔膜消失、裂孔數目減少等病變明顯改善，Nephrin和Podocin表達明顯增加，提示CS具有保護DN大鼠足細胞的作用，其機制可能與其上調Nephrin和Podocin蛋白的表達有關。

［1］Dalla Vestra M，Masiero A，Roiter AM，et al.Is podocyte injury relevant in diabetic nephropathy studies in patients with type 2 diabetes［J］.Dizbetes，2003，52(4):1031-1035.

［2］Camussi G，Mariano F，Biancone L，et al.Effect of cytokines on the eytoskeleton of resident glomerular cells［J］.Kidney Int，1993，39(Supp1):32-36.

［3］Garg P，Verma R，Holzman LB.Slit diaphragm junctional complex and regulation of the cytoskeleton［J］.Nephron Exp Nephrol，2007，106(2):67-72.

［4］Ichimura K，Kurihara H，Sakai T.Actin filament organization of foot processes in vertebrate glomerular podocytes［J］.Cell Tissue Res，2007，329(3):541-557.

［5］Schlondorf J.Nephrin AKTs on aetin:The slit diaphragm-aetin eytoskeleton signaling network expands［J］.Kidney Int，2008，73(5):524-526.

［6］Doublier S，Ruotsalainen V，Salvidio G，et al.Nephrin redistribution on podocytes is a potential mechanism for proteinuria in patients with primay acquired nephrotic syndrome［J］.Am J Pathol，2001，158(5):1723-1731.

［7］林瑞琦，程虹，諶貽璞，等.冬蟲夏草及其制劑在腎臟病中的應用及機制探討(上)［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2009，10(10):924-926.

［8］林瑞琦，程虹，諶貽璞，等.冬蟲夏草及其制劑在腎臟病中的應用及機制探討(下)［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2009，10(11):1016-1018.

［9］黃松.糖尿病動物模型研究現狀及進展［J］.廣西醫學，2002，(1):46-48.

［10］胡征，李華屏，葉茂青，等.冬蟲夏草菌藥理功能研究進展［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(4):20-23.

［11］張興輝，石力夫，胡晉紅，等.冬蟲夏草化學成分和藥理作用研究進展［J］.中藥材，2000，23(11):722-724.

［12］Langham RG，Kelly DJ，Cox AJ，et al.Proteinuria and the expression of the podocyte slit diaphragm protein，nephrin，in diabetic nephropathy:effects of angiotensin converting enzyme inhibition［J］.Diabetologia，2002，45(11):1572-1576.

［13］劉志紅，李世軍，陳朝紅，等.糖尿病腎病患者足細胞病變的臨床病理特征［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2003，8(2):144-148.

［14］鄭云，郝麗，潘夢舒，等.雷公藤多苷對糖尿病大鼠足細胞病變的影響［J］.中華腎臟病雜志，2011，27(4):288-292.