無精子癥患者的染色體核型、Y染色體微缺失分析及診斷

劉春蓮 ，景萬紅，彭 亮，焦海燕，徐 仙

(1寧夏醫科大學總醫院，銀川750004;2寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室;3寧夏醫科大學醫學遺傳學與細胞生物學教研室)

15% ～25%的育齡夫婦患有不育癥，而男性因素占將近50%，其中無精子癥占10% ～20%［1］。精子的產生受遺傳基因的調控和內分泌激素的調節。2009年9月～2010年7月，我們觀察了96例無精子癥患者的異常染色體核型及Y染色體微缺失情況，并探討其診斷方法。現報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 96例無精子癥患者(觀察組)來自寧夏醫科大學附屬醫院生殖醫學中心，年齡19～39歲;連續2次精液分析并經離心沉淀均未發現精子;通過臨床檢查排除生殖道梗阻、精索靜脈曲張等。40例已生育過的男性體檢者為對照組，年齡23～40歲。抽取研究對象的外周血進行細胞遺傳學及Y染色體微缺失檢查;其中42例無精子癥患者(一側睪丸體積≥8 ml，外周血染色體檢測正常)行經皮附睪穿刺精子抽吸術(PESA)或PESA聯合經皮睪丸穿刺精子抽吸術(TESA)。

1．2 方法

1．2．1 常規檢查 ①睪丸體積測定:采用Prader睪丸模型比擬法測定睪丸體積。②血清性激素檢測:于上午9:00～10:00空腹抽取受檢者外周靜脈血3 ml，放射免疫法檢測血清促卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、催乳素(PRL)、睪酮(T)和雌二醇(E2)。

1．2．2 染色體核型分析 取受檢者外周血淋巴細胞培養，制備染色體標本，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察。每例計數30個分裂相，G顯帶分析3～5個核型，結果分析按照人類細胞遺傳學國際命名體制進行。

1．2．3 Y染色體AZF因子檢測 ①DNA的提取:抽取受檢者外周血3 ml，EDTA抗凝。按照全血細胞DNA提取試劑盒說明提取DNA，－20℃保存。②Y染色體AZF因子檢測:采用Y染色體微缺失檢測試劑盒，根據歐洲男科協會(EAA)檢測指南推薦方法進行PCR。每個AZF區域設置2個序列標簽位點(STS):AZFa為SY84、SY86;AZFb為SY127、SY134;AZFc為SY254、SY255。所有DNA樣品均經2次多重PCR完成，稱為Multiplex A和B，每次多重PCR均包括 AZFa、b、c區域的 STS和對照基因引物。PCR產物8 μl經3．0%瓊脂糖凝膠電泳40 min，用Gel Doc2000凝膠成像系統進行DNA電泳條帶的觀察。

1．2．4 PESA和TESA檢查 觀察組選擇睪丸體積較大一側先行PESA。顯微鏡下觀察抽取的附睪液，對精子進行計數。若鏡檢有精子，結束操作;若無精子，行對側PESA;若對側PESA仍無精子，則選擇睪丸體積較大一側行TESA，對抽吸得到的睪丸組織進行鏡檢分析。

1．2．5 統計學方法 采用SPSS11．0統計軟件。計量資料如為偏態分布則用秩和檢驗，如為正態分布則用t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 染色體核型檢測結果 觀察組檢出染色體核型異常者27例(占28．1%)，染色體核型分別為47，XXY 9 例、46，XY(大 Y)6 例、47，XYY 1 例、46，XY(小 Y)9例、46，XY(或47，XYY，－9+)2 例。對照組檢出染色體核型異常者2例，染色體核型分別為46，XY(大 Y)、46，XY(小 Y)。

2．2 AZF檢測結果 觀察組共檢出AZF微缺失7例(占7．29%)，其中AZFc缺失5例、AZFb+c缺失1例、AZFa+b+c缺失1例。對照組未檢測到AZF缺失。

2．3 PESA、TESA檢查結果 觀察組42例患者接受PESA，其中26例顯微鏡下可見精子，診斷為梗阻性無精子癥(OA組)，精子處理后冷凍保存備用;余16例再行TESA，解剖鏡下未見精子，組織病理學檢查證實無精子，診斷為非梗阻性無精子癥(NOA組)。

2．4 睪丸體積和血清性激素檢測結果 OA組和NOA 組睪丸體積分別為(14．92 ±2．78)、(11．25 ±2．76)ml，兩組相比，P ＜ 0．01。兩組血清性激素水平比較見表1。

表1 OA組和NOA組血清性激素水平比較(±s)

表1 OA組和NOA組血清性激素水平比較(±s)

注:與 OA 組相比，*P ＜0．01

組別 FSH(mIU/ml) LH(mIU/ml) PRL(ng/ml) T(ng/ml) E2(pg/ml)OA 組 3．92 ±2．43 3．44 ±1．74 9．41 ±3．85 4．175 ±2．265 40．95 ±24．28 NOA 組 12．99 ±6．12* 6．31 ±2．14* 10．23 ±4．29 3．747 ±2．481*29．53 ±10．95

3 討論

文獻報道，無精子癥患者染色體異常頻率為13．7% ～25．5%［2］，本研究中觀察組為 28．1%。染色體核型異常者均為性染色體異常，異常類型主要有 Klinefehers syndrome(47，XXY)、大 Y(Y≥18)和小Y(Y≤21)。大Y和小Y通常被認為是染色體多態性變異，一般不會引起有害的遺傳學性狀。但是近來的研究表明［3］，染色體多態性與生殖異常如男性不育、精子異常等有關。

Y染色體長臂AZF微缺失也被認為是引起男性生精障礙的一個常見的遺傳因素［4］。有關Y染色體微缺失頻率各地區報道不盡相同，本資料為7．29%。有學者等［5］認為，AZFa缺失表現為惟一支持細胞綜合征的證據，并伴有睪丸體積縮小;AZFb缺失表現為精子成熟障礙，主要停留在精母細胞階段。Imken等［6］研究表明，AZFc缺失患者的睪丸病理表現從正常到無精子。本研究接受TESA的42例無精子癥患者中，發現AZFc位點SY254/255突變1例、AZFc位點SY254/242/255/239和AZFb位點SY254/152突變1例;1例AZFb+c缺失者病理診斷為精子成熟停滯;1例AZFc缺失者病理診斷見成熟正常精子。Oates等［7］報道，Y染色體AZFc微缺失患者，通過輔助生殖技術妊娠的成功病例。本研究中1例AZFc缺失患者接受單精子卵胞漿內顯微注射技術(ICSI)，成功臨床妊娠，目前尚在孕期。Y染色體AZF微缺失的頻率、位置及程度有所不同，可能與種族、地區性差異、遺傳多態現象有關。所以在不同地區進行Y染色體AZF微缺失的檢測具有重要的實際意義。本研究中9例Y染色體微缺失患者中有5例伴有AZF微缺失，兩者有一致性。進一步證實男性不育與染色體異常和Y染色體微缺失密切相關。

本研究發現，睪丸病理檢查為無精子癥的患者睪丸體積明顯縮小，可能由于下丘腦、垂體及睪丸疾病引起，睪丸生精功能受損;無精子組血清FSH、LH均升高，T水平降低，而PRL、E2水平無明顯變化，其原因可能是各種病因致睪丸組織受到損傷，曲細精管上皮廣泛玻璃樣變化和纖維化，使曲細精管分泌的某種抑制垂體FSH、LH分泌的因子減少，同時影響了睪酮的合成分泌。根據無精子癥患者的病史，結合睪丸體積，進行遺傳學相關檢查和血清性激素水平檢測，可以對無精子癥患者的病情做出較為準確的評估，從而對癥治療，減少不必要的手術，并可確認是否有治療價值及是否采用內分泌治療。

［1］陳俊清．528例無精子癥患者病例分析［J］．中國實驗診斷學，2010，14(7):1140-1141．

［2］Martin RH，Rademaker AW，Greene C，et al．A comparison of the frequency of sperm chromosome abnormalities in men with mild，moderate，and severe oligozoospermial［J］．Biol Reprod，2003，69(2):535–539．

［3］鄂偉，關長吉，李學付，等．男性無精子癥和嚴重少精子癥不育患者949例細胞遺傳學分析［J］．中國計劃生育學雜志，2010，18(5):309-310．

［4］Zhang F，Lu CC，Li Z，et al．Partial deletions are associated with an increased risk of complete deletion in AZFc:a new insight into the role of partial AZFc deletions in male infertility［J］．J Med Genet，2007，44(7):437-444．

［5］Martinez-Garza SG，Gallegos-Rivas MC，Vargas-Maciel M，et al．Genetic screening in infertile mexican men:chromosomal abnormalities，Y chromosome deletions，and androgen receptor CAG repeat length［J］．J Androl，2008，29(6):654-656．

［6］Imken L，EiHouate B，Chafik A，et al．AZF mieredeletions and partial deletions of AZFc region on the Y chromosome in Moroccan men［J］．Asian J Androl，2007，9(5):674-678．

［7］Oates RD，Silber S，Brown LG，et al．Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome，and of 18 children conceived via ICSI［J］．Hum Reprod，2002，17(18):2813-2824．