電針對佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹度和炎性細胞因子的影響?

艾坤，武丹，常小榮，劉密，劉梨，劉美榮

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種免疫介導的慢性、炎癥性和破壞性疾病，是一類嚴重危害人類身體健康的常見自身免疫性疾病。針刺療法已被確認對類風濕性關節炎具有較好的療效。本研究通過類風濕性關節炎動物模型(佐劑性關節炎大鼠)觀察相同的電針刺激分別作用于足三里、關元、委中單個腧穴所引起的治療前后大鼠足跖關節腫脹度的變化，以白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α為代表的炎癥相關細胞因子在血漿中含量變化，探討針刺實驗穴位的免疫調整作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年Wistar大鼠60只，雄性，體重180～200 g，清潔級，湖南中醫藥大學動物中心，實驗動物證號SYXKC(湘)2003-0001。隨機分為5組：空白組、模型組、足三里組、關元組、委中組，每組12只。實驗過程中有3只大鼠死亡，其中足三里組1只，關元組1只，空白組1只。

1.2 實驗試劑 液體石蠟、羊毛脂、卡介苗凍干粉(50 mg/支)：北京生物制品研究所；IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α放免試劑盒：北京華英生物技術研究所。

1.3 方法

1.3.1 造模 選用Freund氏完全佐劑(FCA)造模法[1]。FCA制備方法：取液體卡介苗2支(160 mg)，80℃滅活1 h，均勻混入高壓滅菌(121℃、1.1 kg/cm2、30 min)的液體石蠟、羊毛脂(2∶1)16 ml，使混合液的含菌濃度達到10 mg/ml。超聲波細胞粉碎儀乳化20 min。除空白組以外，每只大鼠右足墊皮內注射0.1 ml致敏大鼠。

1.3.2 穴位定位與針刺方法 實驗組分別選擇足三里、關元，針刺對照組選擇委中。取穴定位參照“十五”國家規劃統編教材《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜定位及擬人對照法定位。所有穴位均用直刺。大鼠清醒固定，各穴均用30號1寸針進針后，接華佗電針儀，疏密波，疏波頻率20 Hz，密波頻率100 Hz，強度以針柄輕微抖動為度。每次留針20 min。于造模后第3天開始針刺，隔日1次，共16次。

1.3.3 標本采集 大鼠腹腔注射20%烏拉坦1 ml/100 g，麻醉后斷頭采血，2 ml注入含10%EDTA-Na230 μl和40000 U/ml抑肽酶40 μl的5 ml試管中，上下緩慢顛倒3次混勻，其余3～4 ml注入干燥試管；4℃ ，3000 r/min離心10 min；取上清液放入小試管中，-20℃冰凍保存。

1.3.4 指標檢測 大鼠足跖關節腫脹度采用測量大鼠非致炎跖圍的方法；IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α均采用放射免疫法測定，由北京華英生物技術研究所測定。

2 結果

2.1 大鼠足跖關節腫脹度 造模后，大鼠足跖關節明顯腫脹，模型組與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。足三里組、關元組、委中組治療前后大鼠跖圍比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠跖圍變化(cm)

2.2 血漿IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α含量 模型組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較空白組明顯升高(P＜0.01)，血漿IL-10含量較空白組明顯降低(P＜0.01)。足三里組、關元組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較模型組明顯降低(P＜0.01)，血漿IL-10含量較模型組明顯升高(P＜0.01)；足三里和關元兩組間 IL-1、IL-2、TNF-α、IL-10含量無顯著性差異(均P＞0.05)。委中組血漿IL-1、IL-2、TNF-α含量較模型組有降低(P＜0.05)，血漿IL-10含量較模型組升高(P＜0.05)；委中組血漿IL-1、IL-2、TNF-α、IL-10含量與足三里組、關元組比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.3 相關性分析 大鼠足跖腫脹度與IL-1、IL-2、TNF-α 呈 正 相 關 (r=0.881,r=0.912,r=0.907,P＜0.01)；IL-1、IL-2、TNF-α之間呈正相關(P＜0.01)；IL-10與大鼠足跖腫脹度、IL-1、IL-2、TNF-α呈負相關(r=-0.436,P＜0.01;r=-0.365,P＜0.01;r=-0.519,P＜0.01;r=-0.293,P＜0.05)。

表2 各組大鼠血漿中IL-1、IL-2、IL-10、TNF-α含量(ng/L)

3 討論

佐劑性關節炎(adjuvant arthritis,AA)是以關節滑膜慢性炎癥為主要表現，主要侵犯關節及其周圍組織的自身免疫性疾病，是目前研究針灸免疫調節機制較為理想的動物模型。其原發病變主要表現為致炎局部的炎癥反應，續發病變表現為非致炎足爪腫脹[2-3]。

IL-1具有廣泛的免疫調節作用，并有致熱和介導炎癥的作用。IL-2是一種免疫增強劑，主要由T細胞產生。TNF-α是重要的致炎因子和免疫調節因子。IL-l、IL-2、TNF-α既是炎癥因子，又參與機體的免疫反應。IL-2和TNF-α是免疫促進因子，能促進機體的免疫反應。AA大鼠外周單核細胞和滑膜的巨噬細胞分泌IL-l、IL-2、TNF-α，使外周血和關節滑膜液中IL-l、IL-2、TNF-α明顯升高。因此，本實驗中，AA大鼠血清IL-1、IL-2、TNF-α明顯高于空白組；IL-1、IL-2、TNF-α之間呈正相關，且與大鼠關節腫脹度(跖圍)呈正相關，說明在AA發病中，IL-1、IL-2、TNF-α起著同樣的作用，都是炎癥因子。

針灸治療AA大鼠，主要是降低血清中IL-1、IL-2、TNF-α的含量，從而發揮其免疫調節作用。李熳電針AA大鼠，發現能抑制皮膚組織IL-1Ra mRNA的表達[4]。唐照亮觀察艾灸AA大鼠，能減少血清中IL-1的含量[5]。李世光等研究針灸對RA的免疫調節作用，發現通過IL-2受體百分率下降，IL-2、TNF-α的含量明顯改變，使患者的免疫功能得以改善[6]。唐照亮等觀察AA大鼠失去腎上腺和海馬交感神經的支配，IL-6、IL-2含量上升，艾灸能減輕AA大鼠炎癥腫脹，恢復和促進大鼠松果腺褪黑素(MT)的分泌，使IL-6、IL-2降低[7]。唐照亮等進一步觀察到，艾灸能恢復和促進刀豆素A(ConA)誘導的脾淋巴細胞增殖反應，降低IL-1的含量[8]。本實驗顯示，針灸足三里穴、關元穴后能有效降低AA大鼠血漿IL-1、IL-2、TNF-α水平，且大鼠足跖關節腫脹度(趾圍)明顯降低，相互之間呈正相關。

IL-10有很強的抗炎作用，能明顯抑制單核-吞噬細胞的致炎作用，可能是一種有效的抗炎物質[9-10]。IL-10不僅是誘導外周耐受的一種細胞因子，而且還是一個具有重要免疫調節功能的細胞因子，可抑制中性粒細胞和嗜酸性粒細胞產生促炎癥因子和趨化因子，并通過抑制單核細胞MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子的表達，抑制其抗原遞呈作用。張紅星等發現，頭針可在一定范圍內增強IL-10表達，從而減輕炎癥反應，減輕腦缺血再灌注損傷[11]。研究還發現，針刺能提高正常大鼠IL-10/IL-6比值，升高創傷痛應激所致的免疫抑制患者IL-10/IL-6比值[12]。

有報道急性期RA患者血清中IL-10水平顯著升高，由滑膜液中的單個核細胞自發分泌IL-10。本實驗也發現在AA造模后，血清中IL-10水平有所升高，但至中后期則低于正常大鼠。通過電針足三里、關元后，IL-10水平顯著升高，同時可見AA大鼠足跖腫脹減輕。高水平的IL-10可能是針灸發揮免疫抑制作用的重要因素。

實驗中還發現血漿炎性因子含量以針刺足三里和關元作用最強，說明電針調節免疫具有腧穴特異性。

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