補陽還五湯對急性腦缺血大鼠血管新生影響的實驗研究

李 軍 王朝陽

1廣東藥學院（廣東廣州510006）

2湖北中醫藥大學（湖北武漢430065）

急性腦缺血是神經系統的多發病，約占急性腦血管病的70%～80%，有較高的病死率和致殘率。補陽還五湯是治療缺血性腦損傷的經典方劑，能夠降低患者的致殘率，提高生存質量。為了研究其作用機理是否與促進腦血管新生有關，本實驗采用大腦中動脈線栓法建立急性腦缺血大鼠模型，選擇觀察補陽還五湯對急性腦缺血大鼠腦缺血區微血管密度（MVD）及腦組織血管內皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達的影響，從血管新生的角度探討該方抗腦缺血損傷的作用機理，為臨床應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級SD大鼠100只，體質量 250～300g，雌雄各半，購于湖北省醫學科學院實驗動物中心。

1.2 藥物以《醫林改錯》所載補陽還五湯的藥味和比例配制：黃芪 30g，當歸尾 10g，桃仁 10g，紅花 6g，赤芍 10g，川芎 10g，地龍（研末）6g。中藥飲片購自湖北省中醫醫院，經鑒定符合2005年版《中國藥典》的規定。補陽還五湯制備：加水500mL浸泡30min，武火煎煮沸騰后改用文火加熱30min，收取1次藥液，再加水500mL煎煮，方法同前，去藥渣后用濾紙過濾，將2次藥液混合加熱濃縮至1mL藥液（含生藥1.6g），置于4℃下冷藏備用。尼莫地平片購自正大青春寶藥業有限公司，規格20mg/片，批號080102，用無菌蒸餾水溶解為0.1mg/mL溶液。CD31兔源性多克隆抗體，VEGF和bFGF兔源性多克隆抗體，SABC免疫組化試劑盒，二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、甲酰胺、瓊脂糖，購自Sigma公司；其他異丙醇、無水乙醇、氯仿等常規試劑均為國產分析純。

1.3 動物造模按照文獻［1］方法復制急性腦缺血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛（1.0g/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術操作臺上，取頸正中切口，游離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。結扎頸總動脈、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方剪一小口，將一預先燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈，直到遇到輕微阻力為止，插入深度由分叉部計為（18.5±0.5）mm。固定尼龍線，依次關閉切口。假手術組僅切開皮膚、分離右側頸總動脈后即縫合。術后，腹腔注射青霉素10萬U/只，2次/d，連續3d，預防感染。室溫保持在26～30℃，手術時使用加熱墊。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養盒內，自由飲水、進食。動物于清醒后2h進行神經功能評分，1～3分者入組，若有死亡等不足，動物隨機替補。

1.4 分組與給藥大鼠造模成功后隨機分為模型組、補陽還五湯組和尼莫地平組各10只，另設假手術組，假手術組只打開頸部皮膚，畢露頸部血管后不做其他任何處理即縫合。補陽還五湯組動物于術后第4日起按4mL/kg灌服補陽還五湯藥液，尼莫地平組灌胃給予尼莫地平溶液1mg/kg，每日1次，給藥7d。其他各組動物均給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動。

1.5 神經功能缺損程度評分大鼠清醒后，觀察其行為學變化，神經癥狀參照文獻［2］方法進行5級評分。評分標準：無神經功能損傷癥狀，0分；輕度神經功能損傷（動物前爪不能完全前伸），1分；中度神經功能損傷（動物向癱瘓側轉圈），2分；嚴重神經功能損傷（動物向癱瘓側傾倒），3分；不能自發行走或意識昏迷，4分。各組動物在處死前2h進行評分。

1.6 標本處理給藥后第8日取材。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/100g），剪開胸腔暴露心臟，用灌注針頭刺入大鼠心臟左心室，通過心臟灌注生理鹽水150mL，然后以4%多聚甲醛PBS緩沖液300mL灌注固定，灌流維持20min，灌注效果以動物頭頸堅硬如實木質地為佳。此時，迅速斷頭取腦，可見腦組織色白如蠟。將腦組織置入4%多聚甲醛，PBS緩沖液36h，行外固定。按冠狀切面切成2mm厚腦片6片，取自頭向尾端的第4片，采用常規方法制成5μm厚的腦切片，切片分兩組備用。

1.7 免疫組化檢測免疫組化采用SABC法，DAB顯色。每只動物取海馬部位切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機選3個視野，用Olympus Micro Image 4.0圖像處理系統自動計數免疫陽性細胞數，計算其平均值。MVD計數按Weidner等［3］方法進行，凡染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為1個血管計數，每張切片在同一皮層缺血區選擇10個視野進行微血管計數，計算出每mm2面積內微血管的數量，即微血管密度，然后求其均值。

1.8 統計學處理所有數據以（±s）表示，應用SPSS 12.0統計軟件對數據進行統計分析，組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對急性腦缺血大鼠神經功能和腦組織MVD的影響見表1。尼莫地平組和補陽還五湯組神經功能評分均顯著低于模型組（P＜0.05），補陽還五湯組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；MVD實驗結果顯示，補陽還五湯組MVD顯著高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），補陽還五湯組與尼莫地平組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經功能和腦組織MVD比較（±s）

表1 各組大鼠神經功能和腦組織MVD比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。 下同。

MVD（血管數/mm2）假手術組 10 0 8.21±1.05模型組 10 2.04±0.45* 15.62±1.82補陽還五湯組 10 1.35±0.32* 24.35±2.16*△尼莫地平組 10 1.62±0.35* 18.20±1.55組 別 n 神經功能評分（分）

2.2 對急性腦缺血大鼠腦組織VEGF和bFGF的影響見表2。VEGF在假手術組有少量表達，腦缺血后在缺血半球皮層、室旁區明顯增多；模型組VEGF陽性細胞數與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.01），補陽還五湯組和尼莫地平組與模型組比較顯著升高，差異亦有統計學意義（P＜0.05）；補陽還五湯組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組和補陽還五湯組腦組織bFGF陽性細胞主要分布在梗死灶周圍皮質，梗死灶中心表達較少，假手術組大鼠大腦皮質僅見bFGF少量表達，bFGF陽性細胞呈棕黃色；模型組缺血半球皮質bFGF表達與假手術組比較顯著升高（P＜0.05），補陽還五湯組與模型組和尼莫地平組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽性細胞計數比較 （個/mm2，±s）

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽性細胞計數比較 （個/mm2，±s）

與模型組比較，**P＜0.01。

組 別 n VEGF陽性細胞 bFGF陽性細胞假手術組 10 10.64±1.25** 5.72±0.85*模型組 10 44.25±2.34 9.58±1.62補陽還五湯組 10 64.62±2.20* 12.65±1.26*△尼莫地平組 10 57.64±2.25* 10.20±0.98

3 討 論

補陽還五湯出自《醫林改錯》，為清代名醫王清任所創，由黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，功能補氣活血通絡，主治中風偏癱，口眼歪斜，言語謇澀，口角流涎等癥。補陽還五湯一經問世，便因其療效顯著而得到廣泛應用，備受后世醫家推崇。臨床上用于治療各種腦血管疾病，取得了令人矚目的效果［4］。現代醫學研究證實，補陽還五湯具有擴張血管、增加腦血流量、改善微循環、降低血液黏滯性、抑制血小板聚集、溶解血栓、對抗腦缺血后腦組織損傷等多種途徑發揮臨床作用［5-6］。

腦缺血后由于腦組織缺血、缺氧引起缺血半暗區神經元變性、壞死，而導致神經功能缺損，因此，盡快恢復缺血區的血液供應對缺血后神經功能的恢復至關重要，而缺血半暗區血流的恢復有賴于側支循環的建立。血管新生是改善腦組織血流供應的一種有效方法，對中風患者的預后十分關鍵，是近年來中風研究的熱點之一［7］。在血管新生的研究中，MVD是普遍采用的能夠較直觀和有效反映新生血管的數目和側支循環建立情況的指標。實驗結果顯示，補陽還五湯組的MVD比假手術組和模型組均有所增加，表明補陽還五湯組具有促進腦梗死大鼠腦組織缺血區新血管形成的作用。VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能因子，參與了腦缺血后腦組織的病理修復過程。VEGF可以促血管內皮細胞分裂增殖、增生和轉移，它在血管生成的各個階段均發揮著重要作用，是目前公認的血管新生中最關鍵的因子［8］。bFGF是一種具有強烈促增殖作用的多肽生長因子，在神經元中含量最為豐富［9］。實驗結果顯示，補陽還五湯組可以增加大鼠腦組織VEGF和bFGF的表達，且動物神經功能癥狀得到改善，提示補陽還五湯可促進急性腦缺血大鼠缺血區血管新生，增強腦組織VEGF和bFGF的表達，可能是其抗腦缺血的作用機制之一。

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［4］蓋鳳昌.補陽還五湯在心腦血管疾病中的應用［J］.中國中醫急癥，2005，14（4）：376.

［5］李泓.補陽還五湯治療中風臨床和藥理研究進展［J］.中成藥，1996，18（3）：42.

［6］張麗萍.補陽還五湯防治腦血管疾病的藥理學研究現狀［J］.中國藥房，2007，18（33）：2629-2630.

［7］田兆華，劉柏炎.補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠血管新生的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2010，18（3）：192-198.

［8］Belizon A，Balk E，Feingold DL，et al.Major abdom nal surgery increases plam a levels of vascular endothelial growth factor open more so than m ininally nvasive methods［J］.Ann Surg，2006，244（5）：792-798.

［9］李欣欣，戴德哉.堿性成纖維細胞因子對腦缺血的保護作用［J］.藥學進展，2003，27（1）：23-26.