一氧化氮與胃黏膜細胞凋亡的關系

張曉君 王愛魚 丁瑞峰

(包頭醫學院第一附屬醫院消化科 內蒙古包頭 014010)

細胞凋亡對多細胞有機體的發育、內環境的穩定致關重要,他的異常與腫瘤發生密不可分。近年發現胃癌中不僅存在細胞增生,同時也存在細胞凋亡,胃癌的發生是細胞凋亡與增生比例失調的結果。大量研究證明NO既有細胞保護作用,亦有細胞損傷作用。NO在胃癌的發生和發展中可能起到一定作用,但是,在胃癌的發生發展過程中NO水平及胃黏膜細胞凋亡的關系如何有待于進一步證實。為此,本實驗通過檢測NO在慢性胃病血清中的含量及觀察胃黏膜組織細胞凋亡的情況來探討NO含量與胃黏膜細胞凋亡的關系,為闡述NO在胃癌中的作用提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 觀察對象

于2008年8至月2009年10月在本院胃鏡室就診的慢性胃病及胃癌患者132例,胃鏡下顯示為慢性胃炎和胃癌患者于其病變處取3塊活檢,1塊用AF液固定(備用做切片觀察細胞凋亡),2塊送病理做病理分型,評定結果采用悉尼分類法。胃鏡取材后隨即抽取患者血液2mL,離心收集血清0.5mL置于-20℃冰箱中備用。經病理診斷為慢性淺表性胃炎為40例,萎縮性胃炎(含腸化生、異型增生)60例,胃癌32例,男性88例,女性44例,年齡17～73歲,平均年齡(53.9±12.4)歲。

1.3 方法

1.3.1 NO含量的檢測 采用亞硝基還原法檢測NO的含量,一氧化氮試劑盒由南京建成生物技術有限公司提供,操作程序嚴格按試劑說明書進行,根據公式計算NO含量。

1.3.2 凋亡細胞數的檢測 采用熒光染色法檢測細胞凋亡數,Hoechst染色試劑盒由江蘇碧云天生物技術有限公司提供。常規石蠟包埋,切片,貼片與烤片,脫蠟與水化后PBS液洗兩遍,每次3min,加入0.5mL Hoechst33258熒光染色液,染色5min,再去染色液:用PBS液洗兩遍,每次3min,然后滴一滴抗淬滅封片液,蓋上潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。用激發波長350nm左右的熒光濾片,可檢測到致密濃染的藍色細胞核。每張切片用40×10的物鏡至少連續觀察5個視野,每個視野計數100個上皮細胞中的凋亡細胞數,以平均數為凋亡指數(AI)。

表1 不同病變組NO檢測值與細胞凋亡情況的比較(±s)

表1 不同病變組NO檢測值與細胞凋亡情況的比較(±s)

注:與淺表性胃炎比較,*P<0.01,#P>0.05

例數 NO(umol/L)AI(%）淺表性胃炎萎縮性胃炎胃 癌40 60 32 66.74±19.25(80.31±16.31)*(95.81±13.82)*5.29±1.65(8.45±1.78)*(4.71±1.36)#

1.4 數據處理

2 結果

淺表性胃炎組,萎縮組,胃癌組血清NO含量分別為(66.74±19.25)umol/L,(80.31±16.31)umol/L,(95.81±13.82)umol/L淺表組＞萎縮組＞胃癌組(P<0.01);淺表性胃炎組,萎縮組,胃癌組胃粘膜凋亡指數(AI)分別為(5.29±1.65),(8.45±1.78),(4.71±1.36)萎縮組＞淺表組(P<0.01),胃癌組與淺表組比較無統計學意義(P>0.05),結果見表1。

3 討論

胃癌嚴重影響著患者的健康和生命,迄今為止,人們對胃癌的認識仍然有限,雖然已經有很多腫瘤標志物方面的研究,但是仍然沒有全面揭開腫瘤之謎。研究發現NO在腫瘤的發展方面具有重要作用,對NO的研究可能揭開胃癌研究的新領域。

大量的研究和實驗發現由NO引起的凋亡在許多不同種類的鼠和人的細胞中都可被觀察到。通過觀察發現,由NO引發的細胞凋亡途徑類似于在依賴線粒體凋亡途徑中已查明的信號通路,但前者更強調凋亡執行過程中作為NO目的分子的腫瘤抑制因子p53的作用。實驗表明p53在NO調控細胞周期調節因子或凋亡蛋白(如p21或Bax)的過程中是不可或缺的。NO引發的凋亡其啟動方式在不同生物的細胞中是有所不同的,在通常情況下,NO是通過線粒體介導的途徑引起細胞凋亡的[1]。另一方面,巨噬細胞等在激活或某些病理條件下大量合成釋放NO發揮細胞毒作用。NO氧化生成終末代謝產物為NO3和NO2等,它們比NO更活潑,細胞毒性更大,可氧化DNA,造成鏈斷裂,交叉聯結和堿基修飾等多種DNA損害,從而誘發細胞凋亡[2]。

本研究結果顯示,NO的含量在各病變組為:胃癌組>萎縮(腸化,異型增生)組>慢性淺表胃炎組(P<0.01),慢性萎縮性(腸化生,異型增生)組的AI值均大于慢性淺表性胃炎組(P<0.01),而胃癌的AI值與慢性淺表性胃炎的比較無明顯差異(P>0.05),這與晏楠[3],李子俊[4],尹春華等[5]研究結果相似。該結果提示NO可能與胃癌前病變的關系密切。細胞凋亡的增加一則可導致胃黏膜的萎縮,萎縮性胃炎的形成及胃酸和胃蛋白酶的減少均能增加胃癌發生的危險性。二則由于為了維持胃黏膜的完整性,胃黏膜細胞代償性的增殖加快,而在細胞增殖過程中可能出現不正常的增加,有可能與胃癌的發生有關。另外胃癌中AI的降低可能與早期胃癌中,多種原因使野生型p53基因轉變為突變型,而后者有明顯的抑制凋亡作用有關。

另外,P53與bcl-2在細胞凋亡中的作用已被證實,NO促進細胞凋亡可能是通過促使p53聚集,下調bcl-2,使bax過度表達從而激活caspases蛋白和使DNA裂解[6]。但是NO促進HP引起細胞凋亡的通路還未明了。胃癌的發生是多階段,多基因調控的進展過程,本實驗僅是初步工作,具體機制還有待于進一步研究。

[1]張而立,李松,陳暢,等.一氧化氮與細胞凋亡關系的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2007,28(6):427～429.

[2]辛敏,羅偉生.幽門螺桿菌與一氧化氮關系研究進展[J].廣東醫學,2006,27(3):432～434.

[3]晏楠,呂農華,陳江.幽門螺桿菌感染與細胞凋亡及一氧化氮[J].世界華人消化雜志,2000,8(S):93.

[4]李子俊,陳顏芳,林秋雄,等.一氧化氮在幽門螺桿菌相關性胃病中的可能作用[J].現代消化介入治療,2000,5(2):35～37.

[5]尹春華,張萬岱,曾錦章,等.幽門螺桿菌感染者血清一氧化氮水平及胃粘膜細胞凋亡的變化[J].中國中西醫結合脾胃雜志,2000,8(4):219～220.

[6]Borutaite V,Morkuniene R,Brown GC.Nit ric oxide donors,nit rosot hils,and mitochondrial respiration inhibitors inducecaspase activation by different mechanisms[J].Febs Lett,2000,467(2～3):155～159.