芽孢桿菌 PAS38和β-甘露聚糖對家兔小腸生長抑素的影響研究

文│陳 崗（四川省自貢市動物疫病預防控制中心）沈 潔（四川省自貢市農業廣播電視學校）

芽孢桿菌制劑是一種廣泛應用于生產的微生態制劑，能抵抗各種不良環境，對熱、pH值和鹽具有廣泛耐受性，特別是芽孢桿菌可產生淀粉酶、蛋白酶、β-寡糖酶、超氧化物歧化酶等，因此，芽孢桿菌制劑在畜牧業和發酵工業中發揮著重要作用。寡糖作為一種新型的寡糖添加劑，具有穩定性好、用量小及來源豐富等特點。目前，國內外對益生素和寡糖的研究主要集中在提高動物生產性能、改善腸道微生態環境方面，而對動物腸道黏膜的神經內分泌免疫網絡影響沒有系統報道。本試驗旨在通過對家兔飼喂芽孢桿菌制劑和寡糖制劑，研究其腸道黏膜生長抑素（SS）在小腸黏膜中的分布及其數量變化，從而為研究微生態制劑和寡糖與動物腸道黏膜神經內分泌免疫的關系，提供進一步的試驗依據。

一、材料與方法

1.材料。

（1）實驗動物及基礎日糧。48只40日齡斷奶加利福尼亞兔，雄性，預試五天后，體重750±101克，購自四川省自貢市畜牧局種畜場。試驗基礎日糧：參照家兔的營養需要，基礎日糧配方見表1。

表1 家兔基礎日糧配方%

（2）芽孢桿菌制劑和低聚糖。芽孢桿菌PAS38制劑：由自貢市動物疫病預防控制中心實驗室研制。β-寡糖制劑：購自湖北天琪生物工程有限公司，濃度＞99%。

2.方法。

（1）試驗分組及管理。將48只40日齡加利福尼亞兔隨機分為芽孢（0.1%蠟樣芽孢桿菌）組（簡稱BG）、寡糖（0.15%β-寡糖）組（簡稱OG）、混合（0.1%蠟樣芽孢桿菌＋0.15%β-寡糖）組（簡稱MG）、對照組（簡稱CG），每組12只，見表2。飼喂時間為50天，其中預試期5天，正式試驗45天。早上8點和晚上6點各喂一次飼料。日糧每天按組分別稱量飼喂，并將前次未采食完的日糧全部收集曬干稱重。自由飲水，中午給予同樣質量的青貯飼料。兔舍上下午各打掃一次，保持兔舍內空氣新鮮，保持周圍環境安靜，做好記錄。每日平均溫度為（26±2）℃。

表2 試驗家兔分組情況

（2）標本制備。所有實驗動物于正式飼喂第15、30、45日早上8:00空腹稱重后各組宰殺4只，采取空腸、十二指腸各一段，放入4%多聚甲醛中固定24小時，制成5微米厚的石蠟切片，用APES處理載玻片，用于生長抑素（SS）的免疫組化分析。

（3）免疫組織化學染色方法。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2阻斷內源性過氧化物的活性10分鐘，微波修復抗原1～2次，正常山羊血清封閉非特異性背景20分鐘，依次加入一抗（Mouse Anti-Rabbit Somatostatin，抗體濃度1∶200，4℃過夜），二抗（生物素標記的山羊抗兔，室溫20分鐘），SABC復合物室溫20分鐘，以上各步間均以PBS緩沖液（0.02摩爾/升，pH7.6）洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，觀察，以細胞膜上出現棕黃色顆粒為陽性反應。用PBS代替一抗作為陰性對照。

（4）顯微圖像分析及結果處理。在顯微鏡下觀察，拍照。每例動物隨機選取5張切片，每張切片選取10個400倍視野計數，運用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，并用LSD法做顯著性比較。

二、結果

SS陽性細胞主要分布在腸絨毛上皮之間，腸腺中分布較少。SS細胞中充滿免疫反應陽性物質，尤以基底部及核周圍明顯，在細胞基底面及側面細胞膜外可見免疫反應陽性物質溢出，但腸腔及腺腔內未見免疫反應陽性物質。十二指腸內SS免疫反應陽性細胞多呈圓形和橢圓形，多數細胞為開放型，可見細胞的突起伸向腺腔或腸腔面，見圖1～2。

1.飼料中添加芽孢桿菌和β-寡糖對家兔十二指腸SS陽性細胞的影響。在陽性細胞密度方面，芽孢組十二指腸中SS陽性細胞數量比對照組顯著減少（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，芽孢組和寡糖組十二指腸中SS比對照組顯著減少（P＜0.05），而混合組比對照組極顯著減少（P＜0.01）；飼喂45天之后，各實驗組十二指腸中SS陽性細胞數量已恢復正常水平，與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）結果見表3和圖3。

圖1 十二指腸SS陽性細胞，SABC×400

圖2 空腸SS陽性細胞，SABC×400

表3 家兔小腸中SS陽性細胞密度變化（±s，個）

在平均灰度值方面，飼喂15天后，三個實驗組十二指腸中SS陽性細胞平均灰度值與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，三個實驗組十二指腸中SS平均灰度值比對照組顯著升高（P＜0.05）；飼喂45天之后，各實驗組十二指腸中SS陽性細胞平均灰度值已接近對照組水平，與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。結果見表4和圖4。

表4 家兔小腸中SS陽性細胞平均灰度變化（±s）

2.飼料中添加芽孢桿菌和β-寡糖對家兔空腸SS陽性細胞的影響。在陽性細胞密度方面，飼喂15天后，三個實驗組空腸中SS陽性細胞數量均比對照組顯著減少（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，寡糖組空腸中SS陽性細胞數量顯著減少（P＜0.05），芽孢組和混合組空腸中SS極顯著減少（p＜0.01）；飼喂45天之后，芽孢組和寡糖組空腸中SS陽性細胞數量已經恢復正常水平，而混合組與對照組相比，仍有顯著差異（p＜0.05）， 結果見表3和圖5。

圖3 各組家兔十二指腸SS陽性細胞數量變化的比較

圖4 各組家兔十二指腸SS陽性細胞平均灰度值變化的比較

圖5 各組家兔空腸SS陽性細胞數量變化的比較

圖6 各組家兔空腸SS陽性細胞平均灰度值變化的比較

在平均灰度值方面，飼喂15天后，芽孢組和混合組空腸中SS陽性細胞平均灰度值均比對照組顯著升高（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，寡糖組空腸中SS陽性細胞平均灰度值顯著升高（P＜0.05），芽孢組和混合組極顯著升高（P＜0.01）；飼喂45天之后，芽孢組和寡糖組空腸中SS平均灰度值已經接近對照組水平，而混合組與對照組相比，仍有顯著差異（P＜0.05）。結果見表4和圖6。

三、討論

生長抑素（Somatostatin，SS）陽性細胞分布很廣泛，不僅存在于中樞神經系統，而且存在于所有動物的胃腸道中，是小腸中一種主要的神經內分泌細胞。SS對胃腸道消化吸收及其他內分泌細胞起普遍性的抑制作用，如抑制幾乎所有胃腸激素如胃泌素、血管活性腸肽、胰泌素和胃動素等的分泌；抑制胃腸運動，因此對機體的消化吸收功能有重要影響。許多研究表明SS影響小腸的黏膜免疫反應，楊倩等實驗發現隨著SS水平的降低，小腸上皮內淋巴細胞（IEL）的數量有明顯增多。SS還可以抑制T淋巴細胞的活動和淋巴細胞免疫球蛋白的合成，SIgA是黏膜免疫中最主要的效應因子，SIgA不僅能防止病原微生物在黏膜表面的黏附，還可以通過中和黏膜上皮內的病原體來捕獲進入到黏膜內層的病原體，而SS對IgA合成的抑制作用可高達20%～50%。

本實驗采用免疫組織化學方法，用二氨基聯苯胺（DAB）作為顯色劑對SS陽性細胞進行了標記，與Porter報道結果基本一致，SS陽性細胞主要分布在腸絨毛上皮之間，細胞多為圓形和橢圓形，有突起，屬開放型分泌。實驗結果顯示，芽孢桿菌和寡糖均能夠使家兔小腸中SS陽性細胞密度降低，降低了SS對其他內分泌細胞和胃腸激素的抑制作用，從而增強了胃腸道的消化吸收功能。在小腸固有層中存在大量的免疫細胞，如IgA陽性細胞、肥大細胞及T淋巴細胞等，研究發現，這些免疫細胞上存在SS受體，小腸中SS陽性細胞數量的減少也可使這些免疫細胞的數量增加，從而提高小腸的局部免疫功能。從飼喂的各個時期來看，芽孢組小腸中SS陽性細胞的平均數量均低于寡糖組，說明了兩者單獨使用時，芽孢桿菌對內分泌免疫的調節作用要優于寡糖。兩者聯合使用之后，小腸中SS陽性細胞的數量進一步減少，這可能是因為寡糖可以作為益生菌的增殖劑，促進了芽孢桿菌在腸道中增殖，從而使兩者表現出一定的協同效應。