大黃炮制后化學(xué)組分轉(zhuǎn)移規(guī)律研究

李會(huì)芳，孫 琴，王伽伯，金 城，肖小河

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024； 2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646100；3.解放軍第三○二醫(yī)院全軍中藥研究所，北京 100039）

大黃為常用中藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、解毒、活血化瘀的功效。大黃炮制規(guī)格有多種，《中國(guó)藥典》收載有大黃、酒大黃、熟大黃及大黃炭等4種［1］。現(xiàn)一般公認(rèn)大黃的不同炮制品藥性差異明顯，臨床應(yīng)用中多根據(jù)病證及病情的輕重緩急和適用人群的不同而使用不同的炮制品。因此研究大黃炮制前后化學(xué)組分的變化規(guī)律，可反映不同炮制品的內(nèi)在品質(zhì)，對(duì)于臨床合理選擇大黃的不同炮制品具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜儀（Waters Acquity，美國(guó)），配有二元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及二極管陣列檢測(cè)器（PDA），Empower 2色譜工作站，Waters Ac quity BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），微量分析天平（MettLer ToLedo AL204瑞士）等。HP8452A型分光光度計(jì)為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)用藥材大黃20 kg購(gòu)自甘肅禮縣藥材公司，經(jīng)解放軍第三○二醫(yī)院全軍中藥研究所肖小河研究員鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum paLmatum L.的干燥根。委托北京仟草中藥飲片有限公司（GMP證書(shū)編號(hào)G3256）依據(jù)北京市中藥飲片炮制規(guī)范2006年版進(jìn)行炮制加工，分別得到酒大黃、熟大黃、大黃炭各5批。對(duì)照品：大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為 110756－200110、110796－200310、0757－200206、110795-200504、110758-200509）；沒(méi)食子酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110831-200302）。甲醇為色譜純，水為純凈水，使用前均經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 比色法測(cè)定總鞣質(zhì)成分含量［2］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品25 mg置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置25 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得（每1 mL中含沒(méi)食子酸0.05 mg）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 分別置于25 mL棕色量瓶中，各加磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水 11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL，用 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白用酶標(biāo)儀在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程：C（mg/mL）=69.225A-0.044 3，r=0.998 1；表明沒(méi)食子酸在0.001 mg/mL～0.01 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有較好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液的制備 大黃粉末適量，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色量瓶中，加水30 mL，放置過(guò)夜；超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻靜置，過(guò)濾，棄去10 mL初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 樣品中鞣質(zhì)含量測(cè)定 總酚量：精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL起，加水10 mL，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量（mg），計(jì)算，即得。不被吸附的多酚取供試品溶液12.5 mL，加至已盛有干酪素0.3 g的50 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)；棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL起，加水10 mL，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量（mg），計(jì)算，即得。按下式計(jì)算鞣質(zhì)的含量。

鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量

2.2 UPLC測(cè)定5種蒽醌成分含量

《中國(guó)藥典》（2010年版）一部大黃項(xiàng)下收載的含量測(cè)定方法為高效液相法（HPLC），為蒽醌類(lèi)成分含量測(cè)定的經(jīng)典方法。本文在此基礎(chǔ)上，建立了基于超高效液相色譜法（UPLC）同時(shí)測(cè)定5種蒽醌的方法，樣品的分離速度提高了 8倍［3］。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取大黃素等5種對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得到含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚各40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液作為儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液在4℃避光冷藏可穩(wěn)定保存2個(gè)月以上，將此儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋成含各成分4 μg/mL的溶液作為對(duì)照品工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取大黃樣品粉末適量，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，加入回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件及測(cè)定法 Waters Acquity BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速 0.75 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，進(jìn)樣量 1 μL，柱溫 35 ℃，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（69∶31）為流動(dòng)相。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大黃樣品的典型色譜圖見(jiàn)圖1，對(duì)比圖中（A）和（B），可以看出UPLC方法較傳統(tǒng)的HPLC方法節(jié)約分析時(shí)間8倍以上。大黃不同炮制品蒽醌含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，圖2。從表1、圖2可以看出，大黃炮制前后多組分化學(xué)含量發(fā)生了明顯的變化，其中游離蒽醌含量：熟大黃>酒大黃>生大黃>大黃炭；結(jié)合蒽醌含量：生大黃>酒大黃>熟大黃>大黃炭；鞣質(zhì)含量：生大黃>酒大黃>熟大黃>大黃炭。

各化學(xué)組分變化規(guī)律如下：①游離蒽醌，酒炒后（酒大黃）增加34.88%，經(jīng)酒蒸（熟大黃）后增加70.73%，而炒炭（大黃炭）后損失33.66%。②結(jié)合蒽醌，酒炒后減少7.80%，經(jīng)酒蒸后減少59.07%，而炒炭后損失94.71%。③總蒽醌，酒炒后減少3.86%，經(jīng)酒蒸后減少47.55%，而炒炭后損失89.09%。④鞣質(zhì)，酒炒后減少9.39%，經(jīng)酒蒸后減少85.56%，而炒炭后損失90.64%。

表1 大黃炮制前后多組分成分含量變化表 （‰）

圖1 大黃不同炮制樣品UPLC圖

圖2 大黃炮制前后多組分含量變化圖

3 討 論

大黃炮制過(guò)程中主要對(duì)結(jié)合蒽醌的含量產(chǎn)生了明顯的影響，結(jié)合蒽醌含量減少。結(jié)合蒽醌經(jīng)過(guò)分解，轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x蒽醌。大黃炮制過(guò)程中，每一種結(jié)合蒽醌含量的降低變化趨勢(shì)與結(jié)合蒽醌的總量變化趨勢(shì)基本一致，但游離蒽醌的含量增加與游離蒽醌含量增加的程度不同。其中以大黃酚和大黃素的含量增加最明顯，其次為蘆薈大黃素、大黃酸，而大黃素甲醚略降。

大黃經(jīng)炮制后不僅是以前認(rèn)為的苷類(lèi)水解及所含成分平行下降，而且發(fā)生了復(fù)雜的化學(xué)變化，原藥材中成分比例重新組合，從而導(dǎo)致療效、藥性發(fā)生變化。

生大黃中游離蒽醌與結(jié)合蒽醌的比例為1∶9.8，酒大黃為 1∶6.7，熟大黃為 1∶2.4，大黃炭為 1∶0.8，隨炮制強(qiáng)烈程度游離蒽醌的比例逐漸增加。

大黃炮制前后蒽醌類(lèi)成分的組成和含量發(fā)生了變化，與炮制條件的強(qiáng)烈程度有關(guān)。生大黃、酒大黃中總蒽醌的含量相差不大，熟大黃和大黃炭的總蒽醌含量下降，尤以大黃炭中總蒽醌的含量顯著減少。這可能是因?yàn)槌刺康姆椒l件劇烈，大黃中各成分破壞嚴(yán)重，蒽醌類(lèi)成分受到很大程度的破壞。而熟大黃由于受熱時(shí)間較久，總蒽醌的成分也受到了一定程度的破壞，結(jié)合蒽醌較多地分解為游離蒽醌，游離蒽醌的含量高于生大黃和酒大黃。酒大黃中化學(xué)成分相對(duì)破壞較輕，蒽醌類(lèi)成分在結(jié)合型與游離型之間轉(zhuǎn)化，所以總量變化較小。蒽醌類(lèi)成分含量差異也提示了大黃的不同炮制品之間存在著藥效與毒性的差異。

大黃不同炮制品的鞣質(zhì)含量也與炮制的條件有關(guān)。鞣質(zhì)的含量以生大黃最高，炮制受熱后都不同程度地有所降低，大黃炭中最低，甚至檢測(cè)不到，這可能與鞣質(zhì)含量比色檢測(cè)方法專(zhuān)屬性較差有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實(shí)鞣質(zhì)中d-兒茶素和沒(méi)食子酸是大黃止血的有效成分，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果生大黃的鞣質(zhì)含量最高，止血效果應(yīng)好于大黃炭及其他炮制品。這與傳統(tǒng)認(rèn)為大黃炭的止血作用最強(qiáng)相悖，應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：22.

［2］王伽伯，肖天資，趙艷玲，等.分光光度法與吸附質(zhì)量法測(cè)定大黃鞣質(zhì)含量的對(duì)比研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2009，18（14）：1 369-1 371.

［3］Wang Jiabo，Li Huifang，Jin Cheng，et al.Development and validation of a UPLC method for quality control of rhubarb-based medicine：Fast simultaneous determination of five anthraquinone derivatives［J］.J Pharm Biom Anal，2008，47（4/5）：765.