MK和MMP-26在人乳腺組織中的表達及臨床意義

王玉欣 馬英智 孫 梅

(武警吉林省總隊醫院病理科，吉林 長春 130052)

中期生長因子(Midkine，MK)能調節細胞生長、存活和分化，在人類多種惡性腫瘤中表達增強〔1，2〕。MK在乳腺癌腫瘤組織中的表達無論是表達頻率還是表達程度均明顯高于癌旁正常組織〔3，4〕。MK的高表達程度與預后不良密切相關?；|金屬蛋白酶(MMP)-26在腫瘤侵襲和轉移中起重要作用〔5〕。本文旨在研究這兩種基因在乳腺癌發生、發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有乳腺癌組織及正常乳腺組織均取自2005年12月至2008年6月吉林大學第二醫院住院患者，共計92例。其中浸潤性乳腺導管癌63例，乳腺原位癌7例，乳腺增生14例，正常乳腺組織8例，取自因良性疾病行乳腺切除，及因乳腺良性腫瘤活檢病理回報為正常乳腺組織。所有標本均經嚴格篩選及2名以上病理醫生進行病理診斷。標本固定于10%甲醛固定液中，經取材、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片，切片厚為4μm。烤干后備用。

1.2 方法 免疫組織化學染色步驟:(1)組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水;(2)0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min;(3)枸櫞酸鹽修復重復步驟(2);(4)過氧化物酶阻斷15 min(A液)，重復步驟(2);(5)非免疫動物血清(B液)30 min;(6)以0.01 mol/L PBS稀釋一抗(1∶100)，直接滴加于切片上，30μl/片，4℃過夜后，重復步驟(2)，陰性對照以PBS替代一抗;已知的陽性片作對照。(7)加生物素標記物的二抗(C液)30 min，重復步驟(2);(8)滴加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液(D液)30 min后，重復步驟(2);(9)二氨基聯苯胺(DAB)發色，水洗終止;(10)蘇木精復染細胞核，常規脫水透明，中性樹脂封片。

結果判定:以胞質和胞膜出現棕黃色顆粒為陽性。根據染色范圍和強度界定蛋白的表達，陽性范圍記分:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;染色強度計分:不染色為0分，弱染色1分，中度染色2分，強染色3分。表達最終得分=染色范圍×染色強度，最終得分≥4分為免疫反應陽性(+)，＜4分為免疫反應陰性(-)。

1.3 統計學處理 應用SPSS14.0統計軟件，根據實驗數據資料類型進行χ2檢驗和Spearman等級相關分析等檢驗。

2 結果

2.1 MK在乳腺組織中的表達 MK蛋白陽性表達在正常乳腺組織〔1(12.5%)〕與乳腺增生〔2(14.3%)〕沒有明顯差別(P＞0.05)，而與原位癌〔3(42.5%)〕和浸潤性導管癌〔36(57.1%)〕中的表達有顯著性差異(P＜0.05)。乳腺增生中MK陽性表達與原位癌和乳腺浸潤性導管癌差異顯著(P＜0.05)。原位癌和乳腺浸潤性導管癌中MK陽性表達沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 MMP-26蛋白在乳腺組織中的表達 MMP-26陽性蛋白在正常乳腺組織〔1(12.5%)〕與乳腺增生〔3(21.4%)〕中表達沒有明顯差別(P＞0.05)，而與原位癌〔4(57.1%)〕和浸潤性導管癌〔34(54%)〕有顯著性差異(P＜0.05)。乳腺增生中MMP-26陽性表達與原位癌和乳腺浸潤性導管癌差異顯著(P＜0.05)。原位癌和乳腺浸潤性導管癌中的MMP-26表達沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 MK、MMP-26在人浸潤性乳腺組織中的表達與部分臨床指標的關系 MK、MMP-26陽性表達與腫瘤大小、組織學分級無關(P＞0.05)，但與淋巴結轉移密切相關，MK、MMP-26表達陽性患者淋巴結轉移率明顯高于陰性表達的患者(P＜0.05)。見表1。

2.4 MK蛋白表達與MMP-26表達的相關性分析 MK與MMP-26蛋白在乳腺癌組織中表達呈正相關。見表2。

表1 MK、MMP-26在乳腺癌組織中表達與臨床參數間的關系

表2 MK、MMP-26在乳腺癌組織中表達的相關性(n)

3 討論

MK在多種惡性腫瘤組織和癌前病變中高表達，而在正常組織和良性腫瘤中低表達或不表達〔1〕，并與腫瘤患者的預后密切相關。本文通過對人乳腺癌組織的免疫化學染色檢測MK蛋白在不同乳腺組織中的表達，結果顯示MK在乳腺原位癌組織和浸潤性導管癌中呈高表達，而在乳腺良性增生性病變和正常組織低表達。與以往的研究報道相一致〔6〕，無論是表達頻率還是表達程度，乳腺癌腫瘤組織均明顯高于正常癌旁組織。Trojan等〔7〕采用DNA微陣列技術研究發現MK基因與前列腺癌的轉移有關。在宮頸癌中，Moon等〔8〕用競爭PCR和免疫組化方法發現宮頸癌組織中MK mRNA和蛋白的表達均高于正常對照組，而且其程度與腫瘤大小和臨床分期有關。過高的MK表達在神經母細胞瘤中也提示預后不良〔9〕。Huang等〔10〕研究發現胃癌組織中的MK表達高，并與腫瘤TNM分期及遠處轉移呈正相關，進一步提示MK在腫瘤轉移過程中的作用。已有報道MK在乳腺癌中的表達與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關〔4，6〕。本實驗結果表明MK的高表達與淋巴結轉移呈正相關，但與腫瘤大小和組織學分級無關。

MMP-26與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。本文同時檢測了MMP-26蛋白在不同乳腺組織中的表達，結果表明MMP-26在乳腺原位癌和浸潤性導管癌中呈高表達，并與腫瘤的淋巴結轉移密切相關。已有報道MMP-26在前列腺癌、肺癌、乳腺癌組織中高表達〔11，12〕。Konishi等〔1〕等檢測了 MMP-26 蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達，并分析了其與部分臨床指標的關系，結果顯示MMP-26的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期密切相關，因此推測MMP-26可能在腫瘤細胞的轉移過程中發揮重要作用。

本文還發現在乳腺癌組織中MK蛋白表達與MMP-26表達呈正相關，推斷這兩種基因在乳腺癌發展中相互促進。因此聯合檢測MK和MMP-26蛋白在乳腺癌組織中的表達可以作為判斷腫瘤惡性程度、侵襲能力的指標，并進而判斷預后。

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2 Ye C，Qi M，Fan QW，et al.Expression of midkine in the early stage of carcinogenesis in human colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer，1999;79(1):179-84.

3 Miyashiro I，Kaname T，Shin E，et al.Midkine expression in human breast cancers:expression of truncated form 〔J〕.Breast Cancer Res Treat，1997;43(1):1-6.

4 張燕妮，張春妮，鐘 青，等.MK mRNA在人乳腺癌組織中的表達〔J〕.中國校醫，2001;15(6):405-7.

5 Ripley D，Tunuguntla R，Susi L，et al.Expression of matrix metalloprotei-nase-26 and tissue inhibitors of metalloproteinase-3 and-4 in normal ovary and ovarian carcinoma〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2006;16(5):1794-800.

6 謝 平，陸永良，姚 行，等.中期因子和微血管密度在乳腺癌中的表達〔J〕.中華實驗外科雜志，2004;21(1):92-3.

7 Trojan L，Schaaf A，Steidler A，et al.Identification of metastasis associated genes in prostate cancer by genetic profiling of human prostate cancer cell lines〔J〕.Anticancer Res，2005;25(1):183-91.

8 Moon HS，Park WI，Sung SH，et al.Immunohistochemical and quantitative competitive PCR analyses of midkine and pleiotrophin expression in cervical cancer〔J〕.Gynecol Oncol，2003;88(3):289-97.

9 Ikematsu S，Nakagawara A，Nakamura Y，et al.Correlation of elevated level of blood midkine with poor prognostic factors of human neuroblastomas〔J〕.Br JCancer，2003;88(10):1522-6.

10 Huang Y，Cao G，Wang H，et al.The expression and location of midkine in gastric carcinomas of Chinese patients〔J〕.Cell Mol Immunol，2007;4(2):135-40.

11 Isaka K，Nishi H，Nakai H，et al.Matrix metalloproteinase-26 is expressed in human endometrium but not in endometrial carcinoma〔J〕.Cancer，2003;97(1):79-89.

12 黎 聯，梅同華，周向東，等.細胞外信號調節激酶信號通路與基質金屬蛋白酶-26在肺腺癌表達中的關系〔J〕.第三軍醫大學學報，2009;31(2):136-9.