延髓腹外側頭端活性氧介導室旁核血管緊張素Ⅱ的交感興奮作用

鐘明奎

(安徽醫科大學生理學教研室，安徽 合肥 230032)

下丘腦室旁核 (PVN)與神經內分泌和自主神經系統功能的調節密切相關，其下行纖維可投射到脊髓中間外側柱交感節前神經元和延髓腹外側頭端 (RVLM)〔1〕。PVN存在多種神經遞質及其相應受體，其中血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)及其AT1受體在該區含量豐富。PVN內AngⅡ可通過AT1受體引起血壓升高和交感神經活動增強，在心血管活動的調節中起著關鍵作用。RVLM是心血管功能調節的中心區域，有發放緊張性沖動的心血管運動神經元，腦內升壓、降壓調節區主要通過它投射到脊髓中間外側柱，是中樞神經系統對心血管活動調節的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神經系統和心血管活動的調節中起著重要作用〔2〕。對PVN神經元的化學刺激可使RVLM中的網狀脊髓束血管運動神經元興奮，使血壓升高。然而，PVN內AngⅡ引起的升壓作用是否涉及PVN-RVLM傳出通路及其機制還不清楚。本研究探討RVLM內活性氧 (ROS)在介導PVN內AngⅡ引起的交感神經活動增強的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性成年SD大鼠，體重300～400 g，由南京醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 儀器和藥品 PowerLab/8SP數據分析處理系統、橋式放大器 (ADInstruments，澳大利亞)，交流/直流差分放大器(A-M System Inc.，美國)，腦立體定位儀、微量注射泵(Stoelting Co.，美國)，小動物呼吸機 (Harvard Apparatus Inc.，美國)。AngⅡ、超氧陰離子清除劑4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶 (Tempol)、內源性超氧化物歧化酶擬似物聚乙二醇-超氧化物歧化酶 (polyethylene glycol-superoxide dismutase，PEG-SOD)用生理鹽水配制，NAD(P)H氧化酶抑制劑夾竹桃麻素 (Apocynin)或氧化酚砷 (phenylarsine oxide，PAO)用1%二甲基亞砜 (DMSO)配制，上述藥品均購自美國Sigma公司。

1.3 動物手術 腹腔注射氨基甲酸乙酯 (800 mg/kg)和氯醛糖 (40 mg/kg)混合麻醉，每小時靜脈注射初始麻醉劑量的1/10維持麻醉。頸部正中切口，氣管插管與呼吸機相連行正壓呼吸，右側頸外靜脈插管用于靜脈給藥。暴露雙側頸動脈竇區，分離并切斷所有支配頸動脈竇的神經纖維，切斷雙側迷走神經，剝離頸總動脈分叉處上下各4 mm范圍內動脈周圍結締組織，并涂以10%苯酚溶液以破壞該區域殘余的神經纖維。確認壓力感受器去神經支配成功的標準:靜脈注射苯腎上腺素 (20μg/kg)后平均動脈壓 (MAP)增加25 mmHg以上時心率 (HR)變化不超過5次/min，則壓力感受器去神經支配成功。

1.4 血流動力學和腎交感神經活動記錄 用充有肝素生理鹽水溶液的PE-50聚乙烯管插入右側頸總動脈，經壓力傳感器與四通橋式放大器相連，經PowerLab數據分析處理系統記錄動脈血壓，并對血壓信號進行處理，同步記錄動脈血壓、MAP和HR。經腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露腎臟，游離腎交感神經，并浸入溫石蠟油中，安放銀絲電極引導腎交感神經活動 (RSNA)，經交流/直流差分放大器放大后用Power-Lab數據分析處理系統記錄RSNA，并對RSNA進行積分處理，同步記錄原始RSNA和RSNA積分值。實驗結束時切斷腎神經中樞端以消除腎交感神經傳出活動，記錄噪音水平，RSNA積分值減去噪音積分值即為實際RSNA積分值。RSNA的值以變化的百分率來表示。

1.5 立體定位和微量注射 將大鼠頭部固定于立體定位儀上，暴露顱骨，根據Paxinos和Watson的大鼠立體定位圖譜，定位RVLM(人字縫尖后4.5～5.0 mm，中線旁開1.8～2.1 mm，小腦背側表面下8.1～8.4 mm)和PVN(AP－1.8 mm，RL 0.4 mm，H 7.9 mm)。用針尖外徑為50μm的玻璃微電極向核團內注射藥液，注射容積50 nl，30 s內注射完畢。實驗結束時核團內注射50 nl的0.25%伊文思藍溶液，過量麻醉處死大鼠，取腦，將其放入10%甲醛溶液中固定1 w后，腦組織切片鑒定注射位點。

1.6 實驗設計和分組 (1)PVN內注射AngⅡ對交感神經活動和動脈血壓的影響:大鼠隨機分為4組，每組5只，分別在PVN內注射生理鹽水、3種劑量的AngⅡ (0.03，0.3和3 nmol)，觀察其對RSNA和MAP的影響。(2)RVLM內ROS在介導PVN內AngⅡ效應中的作用:大鼠隨機分為3組，每組6只，分別在RVLM內注射生理鹽水、Tempol(20 nmol)和PEG-SOD(2 U)，10 min后PVN內注射AngⅡ，觀察其對RSNA和MAP的影響。(3)RVLM內NAD(P)H氧化酶在調節PVN內AngⅡ效應中的作用;大鼠隨機分為3組，每組6只，分別在RVLM內加DMSO(1%，50 nl)、NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin(1 nmol)和PAO(1 nmol)，10 min后PVN內注射Ang II，觀察其對RSNA和MAP的影響。

1.7 統計學分析 用SPSS10.0軟件，所有數據均以x±s表示，同一只動物用藥前后觀察值的比較采用配對t檢驗，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析并采用SNK檢驗做樣本間的多重比較。

2 結果

2.1 PVN內注射AngⅡ對RSNA和MAP的影響 PVN內微量注射AngⅡ (0.03、0.3或3.0 nmol)劑量依賴性地引起RSNA增強和MAP升高，但對HR無顯著影響。與生理鹽水組相比，大劑量AngⅡ (3.0 nmol)引起 RSNA〔(0.1±2.2)%vs(12.9±1.9)%，P＜0.01〕和MAP 〔(0.4±1.4)mmHg vs(10.0±1.5)mmHg，P＜0.01〕顯著增加。見圖1。

2.2 RVLM內ROS在介導PVN內AngⅡ效應中的作用RVLM內微量注射超氧陰離子清除劑Tempol對RSNA和MAP無顯著影響，但可明顯減弱PVN注射AngⅡ引起的RSNA增強 〔(0.2±2.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和MAP〔(5.2±1.7)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P＜0.01〕升高效應。RVLM內微量注射PEG-SOD對RSNA和MAP也無顯著影響，同樣也可抑制PVN注射AngⅡ引起的效應，RSNA:〔0.15±1.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和 MAP〔(4.6±2.0)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P ＜0.01〕。見圖2。

2.3 RVLM內NAD(P)H氧化酶在調節PVN內AngⅡ效應中的作用 RVLM內微量注射NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin抑制內源性ROS的生成對RSNA和MAP無顯著影響，但可明顯減弱 PVN注射 AngⅡ引起的 RSNA增強〔(0.2±1.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(5.0±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕升高效應。RVLM內微量注射另一種NAD(P)H氧化酶抑制劑PAO，同樣也可抑制 PVN注射 AngⅡ引起的效應 RSNA〔1.5±2.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(3.5±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕。見圖3。

圖1 大鼠PVN內注射AngⅡ對RSNA和MAP的影響(n=5)

圖2 RVLM內活性氧在介導PVN內效應中的作用(n=6)

圖3 RVLM內NAD(P)H氧化酶在調節PVN內AngⅡ效應中的作用(n=6)

3 討論

PVN是調節交感神經活動和動脈血壓的重要中樞結構之一〔3〕，PVN內AngⅡ可通過AT1受體引起血壓升高和交感神經活動增強，在心血管活動的調節中起著關鍵作用。RVLM有發放緊張性沖動的心血管運動神經元，腦內升壓、降壓調節區主要通過它投射到脊髓中間外側柱，是中樞神經系統對心血管活動調節的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神經系統和心血管活動的調節中起著重要作用。本研究發現PVN內微量注射AngⅡ劑量依賴性地引起RSNA增強和MAP升高。應用超氧陰離子清除劑Tempol和內源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD清除RLVM內ROS，或應用NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin和PAO抑制RLVM內ROS的生成可顯著減弱PVN內注射AngⅡ引起的交感興奮效應。結果表明RLVM內NAD(P)H氧化酶來源的ROS介導了PVN內AngⅡ的交感興奮作用。

Tempol是一種超氧陰離子的清除劑，細胞膜對其具有高度的通透性。本研究發現RVLM微量注射 Tempol幾乎完全消除了PVN微量注射AngⅡ引起的RSNA增強和MAP升高效應，提示Tempol可能通過降低RVLM中ROS水平而起作用。Sun等〔4〕發現AngⅡ增加下丘腦及腦干神經元內ROS生成，且AngⅡ引起的神經元放電活動增強與神經元內ROS水平呈正相關;Lu等〔5〕發現中樞注射Tempol可以抑制側腦室注射AngⅡ引起的RSNA增強，均支持本文結果。考慮到Tempol可能具有一些與清除ROS無關的非特異性作用，筆者又研究了內源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD的作用，結果發現PEG-SOD具有與Tempol相似的作用，進一步提示RVLM中的ROS在介導PVN中AngⅡ引起的交感興奮中起重要作用。

眾多的臨床和實驗研究表明ROS作為信號分子在心血管疾病的發病機制中起著重要作用〔6〕。ROS是氧在生物體內通過單電子還原產生化學性質活潑的物質，包括超氧負離子自由基()、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)等。涉及ROS生成的酶主要包括NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶(NOS)〔7〕，其中NAD(P)H氧化酶在心血管、神經退行性疾病的發病以及在正常心血管、神經系統功能調控中起了重要作用〔8〕。NAD(P)H氧化酶可被某些激素和組織局部代謝產物等激活，使酶的活性顯著增加〔9〕。眾多研究表明在血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、外膜細胞和心肌細胞等多種細胞中，AngⅡ是NAD(P)H氧化酶的重要的激活物之一〔10〕，可上調大部分NAD(P)H氧化酶亞基的基因表達〔11〕，目前NAD(P)H氧化酶和中樞AngⅡ的關系成為人們關注的焦點。Zimmerman等〔12〕用Rac1顯性失活同形物抑制NAD(P)H氧化酶的活性后，AngⅡ所引起的ROS生成也被抑制，同時也消除了中樞AngⅡ引起的升高血壓和增加飲水行為效應。AngⅡ興奮NTS、下丘腦、腦干等中樞自主神經元的效應伴隨著該部分神經元內NAD(P)H氧化酶活性及ROS水平的增加〔13〕，提示AngⅡ可激活外周組織及中樞神經系統NAD(P)H氧化酶。

Apocynin是一種NAD(P)H氧化酶的抑制劑，它通過干擾NAD(P)H氧化酶的裝配，即干擾p47phox和p67phox與NAD(P)H氧化酶的膜復合物結合，從而抑制外周和中樞組織中超氧陰離子的生成〔14〕。PAO是另一種NAD(P)H氧化酶抑制劑，其分子結構和作用機制與Apocynin不同，它不干擾酶的胞漿成分轉移及其與膜成分的結合，而是作用于NAD(P)H氧化酶膜相關蛋白的鄰位巰基結構，與其形成一個穩定的五環結構，從而影響超氧陰離子的生成〔15〕。本研究發現RVLM內注射Apocynin或 PAO均可抑制 PVN內 AngⅡ的作用，提示RLVM內NAD(P)H氧化酶來源的ROS介導了PVN內AngⅡ的交感興奮作用。

本研究發現還發現應用超氧陰離子清除劑Tempol和內源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD清除RLVM內ROS，或應用NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin和PAO抑制RLVM內ROS的生成對RSNA和MAP沒有顯著影響，表明在正常生理狀況下RLVM內源性ROS不參與心血管活動的調節。

綜上，本研究表明RVLM中的ROS介導PVN中AngⅡ 引起的交感興奮增強，NAD(P)H氧化酶是該過程中ROS生成的重要起源。

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