岡田酸誘導SH-SY5Y細胞建立阿爾茨海默病細胞模型超微結構的變化

吳敏霞 許 盈 胡祥炬 林 曦

(福建醫科大學基礎醫學院病理學系電鏡室，福建 福州 350004)

過度磷酸化的tau蛋白可引起微管生成障礙，導致軸漿流中斷，軸索運輸失常，進而引起神經細胞的死亡。課題組前期的研究也證明岡田酸(OA)作用于人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞導致細胞tau蛋白過度磷酸化，與阿爾茨海默病(AD)病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細胞模型〔1〕。在此基礎上，本實驗擬從超微水平揭示AD腦中tau蛋白過度磷酸化導致的微管結構破壞與神經元退變的因果關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞 OA，Sigma公司產品，用二甲基亞砜(DMSO)配成20μmol/L的母液，分裝備用。胎牛血清，杭州四季青生物工程公司產品。1640培養液，Gibco公司產品。其他試劑均為國產分析純。SH-SY5Y細胞，福建醫科大學藥學院藥理學系贈送。CO2培養箱，SHEL LAB公司;倒置相差顯微鏡，Olympic公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SH-SY5Y細胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培養液，置于5%CO2、37℃培養箱中培養，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，待細胞間隙變得較明顯，細胞突起有所回收時終止消化，RPMI1640培養液吹打成單個細胞懸液，3～4 d傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法 以每孔1×104細胞數接種于96孔板，96孔板內的細胞分別每孔加入10，20，40 nmol/L蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和-1抑制劑OA的1640培養液(含2.5%胎牛血清)100 μl，每種濃度4 孔，培養6，12，24，48，72 h。實驗結束后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10μl，37℃，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min，溶解生成的深藍色結晶，選擇波長490 nm，在BIO-RAD Model 450酶標儀測OD490 nm值，作為反映細胞代謝狀況的參數。

1.2.3 光學顯微鏡觀察 接種細胞如MTT法，然后用倒置相差顯微鏡進行觀察、攝片。

1.2.4 超薄切片技術及電子顯微鏡觀察 取SH-SY5Y細胞1 ×106，置尖底離心管，1 000～1 500 r/min，離心8 ～10 min，去上清，沿壁小心滴加3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定數天(或數小時)(4℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗;70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min;在飛利浦EM 208型透射電鏡下觀察、攝影。

1.3 統計學分析 計量資料采用x±s表示，采用方差分析進行組間、組內顯著性比較，當差別有顯著性意義時再用Student-Newman-Keuls檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 MTT比色法繪制細胞生長曲線 模型組20，40 nmol/L細胞活性 OD值(0.264±0.039，0.160±0.013)較對照組(0.514±0.032)顯著減少(P＜0.05);而5，10 nmol/L細胞活性(0.493±0.022，0.478±0.021)與對照組無差異(P＞0.05)。表明20 nmol/L以上OA可致SH-SY5Y細胞活性顯著下降，且呈劑量依賴型。

2.2 光學顯微鏡觀察 20 nmol/L OA作用后細胞數量明顯減少，細胞胞體皺縮，突起縮短消失。見圖1。

2.3 電鏡下觀察 正常組的細胞形態正常，細胞突起處微管結構可見，OA作用于SH-SY5Y細胞后處理組細胞突起回縮，微管結構不清晰。見圖2。

圖1 OA作用于SH-SY5Y細胞24 h形態改變

圖2 OA作用于SH-SY5Y細胞24 h微管的改變

3 討論

AD老年性癡呆主要病理特征為神經細胞間的SP及神經細胞內神經元纖維纏結。神經元纖維纏結由雙股螺旋細絲組成，每根微絲的直徑為10 nm，每隔80 nm有個相互交叉點，形成典型的雙股螺旋狀，這種雙股螺旋細絲由大量異常磷酸化的tau蛋白組成。微管是重要的細胞骨架組成，與有絲分裂，細胞內轉運，細胞特性及細胞標志等多種功能有關。在神經細胞中，微管結構的完整性是神經細胞胞體與軸突間營養物質運輸的基礎。大量的病理臨床研究也證明聯合皮質中含神經元纖維纏結的神經元密度常和癡呆程度有平行關系〔2～4〕。

有關AD動物模型和細胞模型的研究一直是探索的熱點。AD細胞模型是在體外進行誘導和建立，與AD動物模型相比較，具有可避免各種干擾因素，實驗條件容易控制等優點。AD腦中tau蛋白被異常過度磷酸化，每克分子tau蛋白的磷酸含量由2～3 mol增高至5～9 mol，AD腦內的神經元的蛋白激酶系統和磷酸酯酶系統之間的失衡被認為是tau蛋白過度磷酸化的原因〔5〕。Dupont等〔6〕發現，OA 能使 SH-SY5Y 中胎兒 tau蛋白轉變成AD樣磷酸化tau蛋白。因此本課題組前期試驗用OA作用于SH-SY5Y細胞，OA是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化，由此建立AD樣細胞模型。但是對于OA作用后細胞超微形態及微管結構未作進一步研究，本實驗在此基礎上探討AD樣細胞的超微結構變化。

本研究選用OA作用于SH-SY5Y細胞建立AD細胞模型，研究結果顯示，隨著OA作用時間的延長和濃度的逐漸增高，細胞活性逐漸下降，SH-SY5Y細胞形態發生改變較為顯著，出現類似于凋亡的固縮反應。在細胞超微結構上發現，模型組細胞微管結構紊亂，突起回縮明顯，可認為是OA作用后微管相關蛋白tau的過度磷酸化使得微管組裝降低，微管解聚，這與文獻上報道是一致的〔7〕，提示采用本研究方法建立AD模型是可行的。OA可使SH-SY5Y細胞活性降低，微管結構破壞，可作為研究AD的細胞模型。

1 許文芳，吳敏霞，謝捷明.岡田酸誘導SH-SY5Y細胞tau蛋白的過度磷酸化〔J〕.福建醫科大學學報，2006;40(4):361-3.

2 Cummings JL，Vinters HV，Cole GM，et al.Alzheimer's disease:etiologies pathophysiology，cognitive reserve，and treatment opportunities〔J〕.Neurology，1998;51(1-1):2-17.

3 朱粹青，曹小定.調心方藥物血清對動物阿爾茨海默病相關的tau蛋白磷酸化的調節作用〔J〕.中國中西醫結合雜志，2001;21(11):834-6.

4 Mattson MP，Guo Q，Furukawa K，et al.Presenillins，the endoplasmic reticulum，and neuronal apoptosis in Alzheimer's disease〔J〕.J Neurochem，1998;70(1):1-14.

5 Gong CX，Shaikh S，Wang JZ，et al.Phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau:decrease in Alzheimer disease brain〔J〕.JNeurochem，1995;65(2):732-8.

6 Dupont-Wallois L，Sautiere PE，Cocquerelle C，et al.Shift from fetal-type Alzheimer-type phosphorylated Tau proteins in SKNSH-SY 5Y cells treated with okadaic acid〔J〕.FEBSLett，1995;357(2):197-201.

7 Kim D，Su J，Cotman CW.Sequence of neurodegeneration and accumulation of phosphorylated tau in cultured neurons after okadaic acid treatment〔J〕.Brain Res，1999;839(2):253-62.