褪黑素對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響

劉明遠 楊光遠 王躍新 張春斌 白 雪 張建華

(佳木斯大學藥理學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

褪黑素(Melatonin，MT)，是由哺乳動物和人松果體分泌的一種胺類激素，主要經細胞色素(CY)P1A2和CYP2C19代謝，具有鎮靜催眠、抗應激、抗衰老、增強免疫、抗腫瘤等作用〔1～3〕。明確MT對CYP450酶各亞型的影響，對了解其與臨床其他藥物的相互作用、指導臨床合理用藥具有重要的意義。關于MT對肝微粒體酶活性影響的研究，國內外文獻鮮見報道。本課題組前期實驗結果表明，MT對大鼠CYP450含量和CYP1A2、CYP2C19活性無影響。本研究應用甲苯磺丁脲、異喹胍和咪達唑侖為CYP450同工酶選擇性探針底物，進一步觀察MT對大鼠肝微粒體CYP450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的誘導和/或抑制作用，為臨床用藥及相關實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，清潔級，體重180～250 g〔購自佳木斯大學實驗動物中心，合格證號:SYXK(黑)2006-004〕。

1.1.2 主要試劑與儀器 MT(含量＞98%，多多藥業有限公司);甲苯磺丁脲、4'-羥基甲苯磺丁脲、異喹胍、4'-羥基異喹胍、咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖(Sigma公司);Aligent 6310質譜儀、Agilent 1200高效液相色譜系統(美國Agilent公司);752型紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 健康Wistar大鼠24只，雄性，隨機分成三組，每組8只。對照組，灌胃給予生理鹽水，連續給藥7 d;MT給藥組，每日灌胃給予MT(0.54 mg/kg)，連續給藥7 d;苯巴比妥誘導組，自MT給藥組給藥的第5天開始每日腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg，連續給藥3 d。

1.2.2 肝微粒體的制備 動物拉頸椎處死，取出肝臟，立即放于冰冷的0.25 mol/L蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至無血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機制成勻漿;4℃20 000 r/min離心20 min，上清液100 000 r/min離心60 min，沉淀用0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)懸浮均勻，保存于－80℃。

1.2.3 蛋白濃度測定 依據Lowry等方法〔4〕測定。取牛血清白蛋白標準溶液，與銅試劑、Folin phenol試劑反應后，測750 nm吸收度，以蛋白濃度C對吸收度A進行線性回歸得標準曲線。肝微粒體樣品用0.5 mol/L NaOH稀釋適當倍數后同法操作，根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.4 CYP2C9活性測定 選擇甲苯磺丁脲作為特異性底物，參照文獻方法，建立孵化體系及定量測定4'-羥基甲苯磺丁脲的分析方法〔5，6〕。孵化體系中含大鼠肝微粒體蛋白1.0 mg/ml、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、甲苯磺丁脲 30.0 μmol/L，以Tris-HCl緩沖液(pH7.4)定容至500μl，孵化體系中甲醇的終濃度為0.06%，孵化10 min，取樣100μl，加入到200μl冰冷的甲醇中終止反應。樣品處理后，高效液相色譜串聯質譜分析。

1.2.5 CYP2D6活性測定 選擇異喹胍作為其特異性底物，參照文獻方法建立定量測定4'-羥基異喹胍的分析方法〔7〕，孵化體系同1.2.4，異喹胍濃度為50μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為0.1%。樣品處理后，高效液相色譜串聯質譜分析。

1.2.6 CYP3A4活性測定 選擇咪達唑侖作為其特異性底物，參照文獻方法建立定量測定1'-羥基咪達唑侖的分析方法〔8〕，孵化體系同1.2.4，咪達唑侖濃度為100 μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為1%。樣品經處理后，高效液相色譜串聯質譜分析。

1.3 統計學分析 使用SPSS17.0統計軟件，數據資料采用x±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

以各探針藥物的代謝產物的產率 (nmol·mg protein－1·min－1)作為酶活性指標。MT給藥組和對照組大鼠肝微粒體CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性見表1。兩組間比較無統計學差異(P ＞0.05)，說明MT對CYP2C9、CYP2D6、CXP3A4亞型活性沒有抑制或誘導作用。

表1 對照組、MT組 CYP2C9、CYP2D6及CYP3A4 活性(nmol·mg protein－1·min－1，x±s)

3 討論

MT是一種由松果體分泌的神經激素，具有調節睡眠的作用，分泌規律呈夜峰晝谷。青春期后，分泌量隨年齡增長而逐漸下降〔9〕。到中老年時期，體內分泌的MT水平明顯下降，從而使大多數中老年人倍受失眠之苦。失眠癥是臨床上一種常見的疾病，如果得不到有效地控制，可進一步發展為重度抑郁癥〔10〕。在改善睡眠方面，MT呈現明顯的優勢，至今，仍有很多人選擇MT改善睡眠質量。

藥物代謝性相互作用是指同時或先后序貫使用2種或2種以上藥物時，因代謝環節的影響導致療效增強或降低。多種藥物合用時，代謝性相互作用發生率高達藥物相互作用的40%，具有非常重要的臨床意義。代謝性藥物相互作用最常見的原因是CYP450的誘導和抑制。由于老年人除失眠外常合并其他軀體疾病，MT與其他藥物合用在老年人中較為常見。因此，研究MT對肝微粒體CYP450酶的影響具有十分重要的意義。CYP450酶根據其氨基酸序列不同分為不同亞型，人體主要有5 種CYP450 酶，即CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9 和CYP2C19。這5種CYP450酶可以代謝約99%的通過CYP450酶代謝的藥物〔11〕。本課題組前期實驗結果表明，MT對大鼠CYP1A2、CYP2C19活性無影響。為了更全面掌握 MT對CYP450酶的作用，本實驗進一步探討了 MT對肝微粒體CYP450酶CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響，為臨床安全聯合用藥提供理論依據。

本試驗以0.54 mg/kg體重(相當于人體推薦用量)劑量的MT原料藥連續給大鼠灌胃 7 d，測定MT直接給藥對大鼠CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響。結果顯示:Wistar大鼠經過MT處理后，與對照組比較，CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性均沒有變化，提示當MT與某些主要經CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4代謝的藥物合用時，發生代謝性藥物相互作用的可能性較小。

利用探針藥物測定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析和比較不同個體中酶活性的差異，為臨床安全合理用藥提供科學依據〔12〕。本實驗分別以甲苯磺丁脲、異喹胍、咪達唑侖為CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的特異性底物，通過代謝產物的生成速度來評價酶的活性。高效液相色譜-質譜聯用技術檢測靈敏度高、選擇性好，在藥物分析領域應用廣泛，本試驗采用高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定4'-羥基甲苯磺丁脲、4'-羥基異喹胍和1'-羥基咪達唑侖含量，快速、靈敏、簡便。

1 王 萍，周 偉.褪黑素的生物學作用及研究進展〔J〕.國際兒科雜志，2007;34(1):69-72.

2 楊祖銘，馮 星，朱國際，等.褪黑素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后神經元特異性烯醇化酶的影響〔J〕.中國神經精神疾病雜志，2007;33(1):40-2.

3 劉慧霞，劉 旬.褪黑素具有催眠效應的研究〔J〕.菏澤醫學專科學校學報，2007;19(3):16-7.

4 Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent〔J〕.J Biol Chem，1951;193(1):265-75.

5 Zhang S，Song N，Li Q，et al.Liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous evaluation of activities of five cytochrome P450s using a five-drug cocktail and application to cytochrome P450 phenotyping studies in rats〔J〕.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008;871(1):78-89.

6 Maliakal PP，Coville PF，Wanwimolruk S.Tea consumption modulates hepatic drug metabolizing enzymes in Wistar rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2001;53(4):569-77.

7 Stewart NA，Buch SC，Conrads TP，et al.A UPLC-MS/MS assay of the“Pittsburgh cocktail”:six CYPprobe-drug/metabolites from human plasma and urine using stable isotope dilution〔J〕.Analyst，2011;136(3):605-12.

8 Dostalek M，Macwan JS，Chitnis SD，et al.Development and validation of a rapid and sensitive assay for simultaneous quantification of midazolam，1'-hydroxymidazolam，and 4-hydroxymidazolam by liquid chromatography coupled to tandem mass-spectrometry〔J〕.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010;878(19):1629-33.

9 周宇紅，嚴衛星，馮曉蓮.褪黑素改善小鼠睡眠作用的研究〔J〕.中國食品衛生雜志，1997;9(4):27-8.

10 Dooley M，Spencer CM，Dunn CJ.Aceclofenac:areappraisal of itsuse in the management of pain and rheumatic disease〔J〕.Drugs，2001;61(9):1351-78.

11 Bertz RJ，Granneman GR.Use of in vitro and in vivo data toestimatethe likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions〔J〕.Clin Pharmacokinet，1997;32(3):210-58.

12 朱立勤，婁建石.細胞色素P450與藥物代謝的研究現狀〔J〕.中國臨床藥理學與治療學，2004;9(10):1081-4.