不同血清濃度及體外培養時間對小鼠成纖維細胞L929細胞系生長曲線和細胞形態學的影響

董 萍 楊永鵬 丁克祥 劉 敏 羅迎霞 丁 宇 左夏林 韓晉云 楊方應 丁振華

(大連市董萍醫療美容整形醫院美容整形外科，遼寧 大連 116011)

皮膚成纖維細胞是目前研究真皮層乃至整體皮膚老化改變較為重要和敏感的細胞系。Crowston等〔1〕發現，用人體血清培養的人肌腱成纖維細胞凋亡數量減少、增殖旺盛、生長狀態良好。然而，血清中除含有成纖維細胞生存和生長所需基本營養成分和細胞生長因子外，還含有某些細胞毒因子和抗體及酶類等。因此，成纖維細胞體外培養面臨著選取何種血清濃度和介質及培養時間才能使其獲得更好的生存狀態、更高的生長活力等問題。本課題組曾報道〔2〕不同血清濃度和介質對體外培養小鼠成纖維細胞L929細胞系生長曲線和細胞形態的影響，但在不同血清濃度、不同培養時間的條件下對體外培養成纖維細胞生存和生長影響的實驗研究卻報道較少。為此，本文選擇小鼠成纖維細胞L929細胞系，觀察細胞生長周期和細胞形態學以了解不同血清濃度及體外培養時間對成纖維細胞生存和生長狀況的影響，為探索成纖維細胞體外培養提供最佳微環境條件提供一定的參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 小鼠成纖維細胞L929細胞系，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑及配制 新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產品;RPMI1640培養基，Hyclone公司產品;磷酸鹽緩沖劑(PBS)，北京鼎國生物技術有限責任公司產品;乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，上海生物工程有限公司產品;三氯乙酸(TCA)，天津市科密歐化學試劑有限公司產品;磺基羅丹明B(SRB)，購自Sigma-Aldrich公司;吖啶橙染液(AO)，購自Sigma公司;蘇木素-伊紅(HE)染液，購自中杉金橋試劑公司;醋酸，天津市化學試劑三廠產品;Tris堿，長沙鵬程生物公司產品;多聚甲醛，太陽生物公司產品;氨水，廣東光華化學有限公司產品;鹽酸，湖南省株洲市化學工業研究所產品;乙醇，天津市大茂化學試劑廠產品。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱，德國Heraeus公司產品;超凈工作臺，Heal force，上海申力科學儀器產品;BIO-RAD 550酶標儀，BioRad公司產品;OLYMPUS倒置顯微鏡、OLYMPUS BX-60熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品;R200D電子天平，德國Storius公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠成纖維細胞L929細胞系培養 小鼠成纖維細胞L929細胞系用含10%新生牛血清的 RPMI1640培養基，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養;待細胞達匯成片后，0.25%EDTA胰酶消化培養瓶細胞，血細胞板計數并制成細胞懸液;分別以2 500/孔接種于96孔細胞培養板，以10 000/孔接種于24孔細胞培養板。

1.2.2 分組 將貼壁后細胞按生長時間分組為:2、4、6、8 d組;按培養液中血清濃度分組為:0%組、20%組、40%組、60%組、80%組、100%組，各濃度設7個平行。按照配方配制各組培養液，見表1。

表1 不同濃度血清培養液具體配制方案

1.2.3 SRB法檢測細胞生長 96孔板細胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養液;按實驗分組每孔加入200μl含不同濃度血清的RPMI1640培養液;37℃，5%CO2恒溫培養箱中分別培養2、4、6、8 d，并取細胞培養板檢測。棄掉培養液，PBS沖洗1～2次，每孔加入100μl 10%TCA，4℃固定1 h;棄掉TCA，去離子水沖洗3～5遍，干燥。每孔加入100μl 0.2%SRB染液，室溫下染色30 min;棄掉染液，用1%醋酸洗掉未結合的染液，干燥。每孔加入200μl pH10.5的10 mmol/L非緩沖Tris堿液，置搖床低速振蕩20 min。在酶標儀A490波長下測量各孔的吸光值(OD值)，記錄分析。

1.2.4 HE染色 HE染細胞核著紫藍色，使細胞質中的成分著淡紅色。①干預:24孔板細胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養液;按實驗分組每孔加入400μl含不同濃度血清的RPMI1640培養液;37℃，5%CO2恒溫培養箱中分別培養2、4、6、8 d，并取細胞培養板檢測。②固定:棄掉培養液，PBS沖洗，每孔加入200μl 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，棄掉固定液，PBS沖洗。③染色:HE染色5 min，吸掉染液，流水洗掉未結合的HE染液。④分化:1%鹽酸乙醇瞬間分化，流水稍微沖洗。⑤返藍:5%氨水返藍5 s，流水沖洗。⑥ 復染:HE染液復染20 min，吸掉染液，蒸餾水洗掉未結合的染液。⑦ 拍照:倒置顯微鏡下200倍拍照。

1.2.5 AO染色 吖啶橙與細胞核內DNA結合呈綠色熒光，與細胞質內RNA結合呈橘紅色熒光。①24孔板細胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養液;按實驗分組每孔加入400μl含不同濃度血清的RPMI1640培養液;②37℃，5%CO2恒溫培養箱中分別培養2、4、6、8 d，并取細胞培養板檢測棄掉培養液，PBS沖洗，避光，每孔加入200μl吖啶橙染液，搖床振蕩染色5 min。③去染液，PBS沖洗2次，搖床振蕩，每次5 min。④吸盡液體，熒光顯微鏡下藍光激發200倍拍照。

2 結果

2.1 細胞形態學實驗結果 見圖1。

2.1.1 HE染色 在同一生長時間下，無血清組細胞變圓、核固縮，很多細胞核呈現不規則形狀且被深染，僅存幾個細胞形態正常。隨著血清濃度的升高，細胞形態恢復正常，但100%血清濃度組細胞凋亡現象較為嚴重，細胞變圓、凋亡核固縮比較明顯。隨著生長時間的增加，各20%、40%、60%血清組細胞數量呈現增加趨勢，細胞形態也大多正常;80%血清組細胞出現空泡化現象，100%血清組細胞空泡化現象非常嚴重。

2.1.2 AO染色 在同一培養時間下，無血清組細胞大部分核固縮為半月形，極少數保持原有細胞形態且質中有RNA的存在;而隨著血清濃度的增加，細胞形態恢復較快，固縮半月形細胞核的比例也很快減少，質中RNA的存在也表明細胞大部分處于增殖生長的階段;而高濃度血清組細胞的形態發生改變，凋亡細胞核固縮比例增加，很多細胞核呈亮染半月形。隨著生長時間的增加，細胞在大量增殖的同時，由染色圖片可看出，細胞形態開始發生不規則改變，大量細胞亮染、核固縮并出現凋亡小體。

圖1 不同血清濃度、不同生長時間AO和HE染色細胞形態(×200)

2.2 SRB法測定細胞生長曲線實驗結果

2.2.1 血清濃度對細胞生長的影響 20%組和40%組細胞可以正常生長，隨著血清濃度的增加，特別是血清濃度達到60%及以上，對細胞生長產生明顯的抑制作用。其中，0%組OD值明顯低于其他濃度組，可見0%組對細胞生長有較強的抑制作用;而20%組相對于0%組而言，OD值呈現快速增加趨勢，對細胞促進作用較強;20%組和40%組OD值沒有明顯的趨勢變化，此間血清濃度變化對細胞的生長影響不是太大。此后，在相同的培養時間下，隨著血清濃度的升高，SRB法測定細胞的OD值逐漸減小，對細胞生長具有抑制作用，尤其是100%血清組抑制作用較為明顯。見圖2。

2.2.2 生長時間對細胞生長的影響 在適當的培養時間內，隨著細胞生長時間的延長，除0%組OD值無明顯變化只呈現微弱的降低趨勢外，其余濃度組OD值一直處于增加狀態;各濃度組OD值在4 d之內增加迅速，細胞生長較快;生長時間在4～6 d時，OD值增加趨勢較弱;6～8 d時，增加趨勢又有所增強;其中，100%組OD值在此期間(4～6 d)增加趨勢非常明顯，細胞生長很快。見圖3。

圖2 血清濃度對細胞生長影響柱形圖

圖3 生長時間對細胞生長影響柱形圖

3 討論

皮膚衰老是隨著年齡增長而發生的皮膚生理性衰老，與真皮成纖維細胞減少、衰老密切相關〔3〕。成纖維細胞是普遍存在于結締組織中的一種中胚層來源的細胞，細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，其細胞核呈規則的卵圓形，核仁大而明顯，其基本功能是合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和葡聚糖、糖蛋白等細胞外基質成分和細胞因子，同時在傷口愈合過程中可遷移到傷口進行增殖。異體真皮衍生物(dermalogen)、透明質酸、微粒化異體真皮(alloderm)等在臨床中的應用皆存在各種問題的出現，從而限制了其發展。

血清中含有豐富的氨基酸、肽類、蛋白質、核酸及其關聯物質、糖類、脂類、微量元素、某些維生素及其他有機物，這些物質是細胞生存和生長所需微環境的重要條件之一。而血清中的多種生長因子，包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子、神經生長性因子等能夠特異性與目的細胞膜上受體結合，并通過細胞信號傳導通路促進和加快細胞的增殖及生長代謝及相關因子的表達。例如，堿性成纖維細胞生長因子就是一類能促進來源于中胚層和神經外胚層細胞有絲分裂并誘導其分化的多肽生長因子。除此之外，一些微量元素和離子，如Zn、Se、Mn、Ge等，可作為某些重要酶的輔基在代謝解毒及抗氧化等方面起重要作用。正是由于血清具有這些多樣性的生物學特性，使其越來越多地應用于多種細胞的體外培養，例如成纖維細胞、軟骨細胞等。血清多樣性的生物學特點可以促進中胚層細胞(包括成纖維細胞、血管內皮細胞等)分裂增殖，同時促進新生細胞和有活力細胞的數量不斷增多，不斷產生膠原蛋白、彈性蛋白、透明質酸、皮膚素等成分。雖然血清富含營養成分，具有豐富的生物學特性，但是如何使體外培養條件達到體內環境的標準仍然是目前所面臨的問題。原因在于血清成分和生物學作用復雜，血清濃度過小時促貼壁和擴展因子、黏附因子、結合蛋白等物質缺失〔4〕，從而造成細胞衰老、細胞附著性降低、細胞核裂解空泡化或胞質顆粒變性等;而血清濃度過大可能會造成成纖維細胞體外培養所需營養不足，且其含有的細胞毒性物質和抑制物質對細胞有去分化作用，可能影響某些細胞功能的表達。Ojeh等〔5〕認為成纖維細胞在100 ml/L血清濃度培養基中生長良好，但劉鵬等〔6〕人認為豬和鼠的成纖維細胞在這種培養基中狀態不良，易老化，不能取得令人滿意的效果。與此同時，成纖維細胞的倍增時間較短，一般3～4 d可傳一代，但除了在不同血清濃度下同一生長時間成纖維細胞生長情況不同外，在相同血清濃度下、不同生長時間下，成纖維細胞生長情況也不同。

本實驗在不同血清濃度(0%，20%，40%，60%，80%，100%)及不同生長時間(2，4，6，8 d)條件下，比較體外培養小鼠成纖維細胞L929細胞系生長曲線和細胞形態，結果可見在相同生長時間下，0%組對細胞生長有較強的抑制作用，20%、40%對細胞均有較強促進作用;而當血清濃度超過60%，SRB法測定細胞的OD值逐漸減小，對細胞生長具有抑制作用，尤其是100%血清組抑制作用較為明顯。進一步發現，無血清組(0%)幾乎無正常形態細胞，20%、40%、60%的血清濃度中，細胞形態逐漸恢復正常;而超過60%的血清濃度會造成細胞凋亡。而隨著生長時間的增加，各濃度組OD值在4 d之內增加迅速，細胞生長較快。高濃度的血清組可見細胞凋亡。本實驗結果說明，如果從血清濃度和細胞生長時間等綜合因素考慮，當血清濃度為20%、40%、60%，細胞生長時間為2～4 d時，成纖維細胞體外培養環境較佳。因此，在利用血清進行成纖維細胞體外培養時，應充分考慮血清濃度和細胞生長時間對細胞生長和形態的影響。

然而，本實驗尚未對細胞培養后培養液中血清蛋白、細胞因子、無機元素和pH值等進行測定，因此，目前尚未知成纖維細胞培養過程中產生的代謝產物或表達產物釋放到細胞培養液后是否會引起其pH值、血清濃度及其他成分變化。特別是，此階段的實驗研究尚未知成纖維細胞培養過程中是否出現其代謝產物或表達產物的改變，如是否會影響到成纖維細胞通過攝取所需的氨基酸、在粗面內質網的核蛋白體上合成前α多肽鏈、多肽鏈輸送到高爾基復合體后組成前膠原分子、前膠原分子由分泌囊泡帶到細胞表面，然后通過胞吐作用釋放到細胞外等生物學過程，而這個過程是否出現不同膠原蛋白亞型及其比值的改變，將是下一步深入探索和研究的內容和方向。

1 Crowston JG，Wang XY，Khaw PT，et al.Human serum reduces mitomycin-C cytotoxicity in human tenon's fibroblasts〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006;47(3):946-52.

2 楊永鵬，董 萍，丁克祥，等.不同血清濃度及介質對體外培養小鼠成纖維細胞L929細胞系生長曲線和細胞形態的影響〔J〕.國際老年醫學雜志，2010;31(6):241-9.

3 McCullough JL，Kelly KM.Prevention and treatment of skin aging〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;10(1067):323-31.

4 劉 蘋，李 平，周元國，等.血清濃度對TGF-β1刺激成纖維細胞增殖的影響〔J〕.西南軍醫，2008;10(5):1-3.

5 Ojeh NO，Frame JD，Navsaria HA.In vitro characterization of an artificial dermal scaff old〔J〕.Tissue Eng，2001;7(4):457-9.

6 劉 鵬，金 巖，劉 源，等.不同種屬真皮成纖維細胞在不同血清濃度培養基中生長的比較觀察〔J〕.實用口腔醫學雜志，2004;20(1):16-9.