姜黃素誘導A549細胞凋亡過程中活性氧水平和caspase-3活性的變化

張 靜 連超群 陳傳好 胡明潔 吳守偉

(蚌埠醫學院生物科學系遺傳教研室，安徽 蚌埠 233030)

傳統的肺癌化療常因嚴重損害人體正常組織細胞而使臨床應用受到限制，尋找毒性低、副作用小的治療藥物成為近年來腫瘤基礎和臨床研究的熱點。姜黃素(Curcumin)是從我國傳統中藥姜科植物姜黃的根莖中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化和降血脂等多種藥理作用〔1，2〕。近年來研究發現，姜黃素可能是一種有開發前景的天然抗癌新藥，其在體外對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡的作用，而對正常組織細胞幾乎無毒性〔3，4〕。本研究以人肺腺癌細胞系A549為研究對象，通過檢測姜黃素對體外培養腫瘤細胞凋亡的影響和細胞內活性氧(ROS)水平和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的變化，探索姜黃素對腫瘤細胞的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。小牛血清為杭州四季青公司產品，RPMI 1640購自 Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、Hoechst 33258購自Sigma公司。姜黃素購于美國Sigma公司，以少量DMSO溶解姜黃素粉劑，配成10 mmol/L貯存液，－20℃保存，臨用時以完全培養液稀釋至所需濃度。caspase-3活性檢測試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司，ROS探針2，7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(2，7-dichlo-ro fluorescein diacetate，DCFH-DA)購自Molecular Probes公司，余為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌A549細胞培養 人肺癌A549細胞株用含10%小牛血清的RPMI1640培養液，在5%CO2、37℃培養，細胞呈貼壁生長，用0.25%胰酶消化傳代，用于實驗的細胞均處于對數生長期。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 取對數生長期的A549細胞，調整細胞濃度為2×104個/ml，按每孔2 000個接種于96孔板，每孔100μl。37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，以姜黃素終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L 處理細胞。每個濃度設6 個平行孔，并同時設陰性對照和空白對照，分別于作用12、24、36、48 h后每孔加入50 mg/L MTT溶液20μl，37℃孵育4 h后，終止培養，小心吸去上清，每孔加入150μl DMSO，振蕩器震蕩10 min，完全溶解結晶，酶標儀在570 nm處測量各孔吸光度(A)值，按以下公式計算細胞增殖抑制率(%)=(對照組平均A570值－給藥組平均A570值)/對照組平均A570值×100。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡 將對數生長期A549細胞以3×105個/ml接種于35 mm Petri培養皿底中間的圓形凹槽里，待24 h貼壁后，分組進行藥物處理，分對照組和姜黃素實驗組，對照組只加培養液和細胞，實驗組分別加入5、10、20、40、80μmol/L的姜黃素。作用 48 h后棄培養基，4%多聚甲醛4℃固定10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加10μg/ml的Hoechst 33258染色液于避光染色15 min，PBS漂洗。利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測分析，激發波長為405 nm，吸收波長為(450±15)nm。

1.2.4 細胞內ROS水平測定 細胞處理方式以及給藥方法同1.2.3項，藥物作用48 h后吸出培養皿中的培養液，用PBS洗滌2～3次后，加入DCFH-DA液，使終濃度為10μmol/L，在37℃、5%CO2培養箱內避光培育20 min，吸除染液，用PBS洗滌3次，利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測其熒光強度，分析ROS水平，激發波長為488 nm，吸收波長為(590±50)nm。

1.2.5 caspase-3活力檢測 將對數生長期A549細胞以3×105個/ml接種于6孔培養板培養24 h后，分組進行藥物處理，藥物處理同 1.2.3項，藥物作用 48 h后，收集細胞，按照100μl/200萬個細胞的比例加入裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，1 2000 r/min離心15 min，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中，置于冰上;按試劑盒說明進行操作，使用酶標儀在405 nm測定caspase-3的酶活性，OD405即為樣品中caspase-3催化產生的pNA(p-nitroaniline)產生的吸光度，其值大小反映caspase-3活性強弱。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.0統計軟件進行處理，數據以x±s表示。各組間采用單因素方差分析對所得實驗數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 姜黃素對A549細胞增殖的抑制作用 姜黃素對人肺腺癌細胞系A549細胞生長具有抑制作用，且呈現濃度和時間依賴關系。在同一濃度作用下，姜黃素實驗組的細胞生長抑制率隨作用時間的延長而增大。在同一處理時間，隨著姜黃素濃度的增加，除了5μmol/L的姜黃素作用12 h外，其余各實驗組與對照組比較細胞抑制率的差異均有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。5～80μmol/L的姜黃素對A549細胞作用48 h時抑制效果最佳，最大抑制率達80.60%。見表1。

2.2 姜黃素誘導A549細胞凋亡的形態學變化 Hoechst 33258熒光染色照片顯示，陰性對照組細胞核膜完整，核呈圓形或橢圓形，染色質分布較均勻，細胞核為藍色均勻淡染。不同濃度姜黃素作用A549細胞48 h后，部分細胞出現核體積變小，核固縮，細胞核出現碎裂，呈現致密的藍色顆粒狀熒光，表現為典型的凋亡形態學改變，表明姜黃素對A549細胞的增殖抑制可能與細胞凋亡有關。見圖1。

2.3 姜黃素對A549細胞ROS的影響 以熒光強度反映ROS水平。陰性對照組熒光強度較微弱，ROS最低，姜黃素處理A549細胞48 h后胞內ROS濃度增加，具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，并且ROS隨姜黃素劑量的增加而升高，呈一定的劑量依賴關系。見表2。

2.4 姜黃素對A549細胞caspase-3活性的影響 以OD405反映caspase-3活性強弱。經不同濃度姜黃素作用48 h后的A549細胞內caspase-3活性均較陰性對照組增強，與陰性對照組相比，除5μmol/L姜黃素實驗組外，其余各濃度實驗組差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

圖1 Hoechst33258熒光染色姜黃素對A549細胞核形態的影響(×400)

表1 姜黃素對A549細胞抑制率的影響(x ±s，n=3，%)

表2 姜黃素對A549細胞ROS及caspase-3影響(x ± s，n=3)

3 討論

細胞凋亡作為一種基本的生命現象，在維持機體自身穩定中起重要作用，不僅在正常的組織中存在，在腫瘤組織中亦廣泛存在。研究發現腫瘤的發生、發展及產生耐藥與細胞凋亡有密切關系〔5〕。使用能夠促進腫瘤細胞凋亡、抑制其生長的抗癌藥物是目前腫瘤治療的主要手段之一。姜黃素是從姜黃、郁金、莪術、菖蒲等傳統中藥根莖中提取的一種植物多酚，可抑制多種腫瘤細胞生長、誘導凋亡、抑制轉移和提高腫瘤細胞化療敏感性。由于其明顯的廣譜抗腫瘤活性，美國國立腫瘤研究所已將其列為第3代癌化學預防藥〔6〕。本研究顯示，姜黃素對體外培養的人肺腺癌細胞A549增殖有明顯的抑制作用，并且表現出明顯的劑量和時間雙重依賴性(P＜0.05)。A549細胞在姜黃素的作用下出現胞體變小、核固縮、破碎等典型的細胞凋亡形態學特征。

研究表明氧化應激參與了細胞凋亡的過程，并起了關鍵作用。ROS是細胞有氧呼吸過程中產生的O2代謝產物及其衍生的含氧物質的統稱，包括所有的含氧自由基和過氧化物。ROS在凋亡中的作用日益受到重視，很多證據提示在促凋亡信號作用下ROS的升高可能作為第二信使上調促凋亡蛋白表達，促進線粒體通透性轉變孔的開放，激活天冬氨酸特異的caspase，參與Ca2+途徑等，誘導細胞凋亡。同時ROS的水平可能通過影響caspase的活性和三磷酸腺苷水平決定細胞對促凋亡信號的效應，或凋亡或壞死，或耐受。很多抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞DNA片段化并誘導凋亡均與引發ROS改變相關〔7，8〕。研究表明姜黃素具有調節ROS的作用，Bhaumik等〔9〕發現姜黃素能促使BC-8〔激酶基因內含子5(AK-5的單細胞克隆)〕細胞的細胞膜發生功能和結構變化，導致早老蛋白(PS)殘基外顯，促進自由基的釋放，且有助于細胞外的ROS進入細胞發揮活性。本實驗應用熒光染料 DCFH-DA檢測細胞內ROS的變化，DCFH-DA可自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH，在ROS存在下被氧化成DCF，DCF在一定波長激發光激發后產生綠色熒光，綠色熒光強度的高低與ROS濃度成正比。研究結果顯示人肺腺癌A549細胞在不同濃度姜黃素的作用下，其細胞內熒光強度顯著升高，表明姜黃素的作用可促使細胞ROS水平顯著升高，且隨姜黃素劑量的增加而升高。說明氧化應激參與姜黃素誘導A549細胞凋亡過程，ROS的增多可激活多種凋亡途徑，尤其在線粒體凋亡途徑中扮演重要的角色，從而誘導A549細胞凋亡。

caspase是存在于哺乳動物細胞中的一組蛋白酶家族，在細胞凋亡過程中起重要作用。caspase一經激活，將產生級聯反應，最終導致細胞凋亡。caspase-3是caspase家族成員中執行細胞凋亡的關鍵蛋白酶，被激活后裂解產生17 kD的活性亞單位發揮作用，參與caspase的兩條不同激活途徑(死亡受體-caspase-8和細胞色素C-caspase-9酶原激活途徑)。研究表明姜黃素的抗腫瘤作用可能與caspase的激活有關，孫陽〔10〕研究發現姜黃素明顯抑制人腦膠質瘤細胞(SHG-44)的增殖，誘導SHG-44細胞凋亡，caspase-3活性增強，各種caspase抑制劑可抑制姜黃素誘導的SHG-44細胞凋亡。Khar等〔11〕報道，姜黃素誘導AK-5細胞凋亡過程中，caspase-3活性明顯增高，且通過caspase-3抑制劑(DEVD)的抗凋亡作用及Western印跡得到證實，表明caspase-3參與姜黃素的誘導凋亡過程。本研究結果顯示姜黃素各濃度實驗組的caspase-3活性均明顯升高，并具有濃度依賴性。表明姜黃素誘導A549細胞凋亡過程中存在caspase-3的活化，提示姜黃素可能通過激活 caspase-3誘導A549細胞凋亡。

綜上所述，姜黃素可能通過ROS水平的升高激活caspase-3從而誘導A549細胞凋亡。然而凋亡是一個非常復雜的過程，姜黃素究竟通過那條信號途徑誘導A549細胞凋亡仍有待深入研究。

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9 Bhaumik S，Anjum R，Rangaraj N，et al.Curcumin mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves the production of reactive oxygen intermediates〔J〕.FEBSLett，1999;456(2):311-4.

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