鈣通道阻滯劑對大鼠坐骨神經損傷后局部膠原蛋白沉積的影響

薛金偉 凌 麗

(河北大學附屬醫院，河北 保定 071000)

周圍神經損傷后的修復無疑是顯微外科的一道難題，影響其功能恢復的因素是多方面的，其中最常見的抑制因素是神經吻合口膠原纖維增生所形成的創傷性神經瘢痕。它在神經束內會形成物理性屏障，阻礙軸索的延伸〔1〕;在神經系膜及外膜則形成組織粘連，阻礙神經正常滑動。當肢體運動帶動神經滑動時，局部粘連及神經纖維波浪狀結構喪失，又會使神經伸展能力降低，這樣縱向的拉力集中于損傷局部轉化成垂直于神經干的環向壓力，造成機械性卡壓，阻斷神經血運及軸突的運輸，導致髓鞘變性、軸突斷裂，影響神經功能恢復。可見，減輕及軟化神經瘢痕，降低粘連，能在很大程度上改善神經的恢復情況〔2〕。近年來研究發現鈣通道阻滯劑可抑制成纖維細胞增殖，降低膠原的合成和分泌，對瘢痕形成有良好的抑制作用〔3，4〕。本文應用這一研究瘢痕的模型和方法，觀察了維拉帕米對神經損傷處瘢痕形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 選用清潔級2月齡雄性SD大鼠120只，健康，體重220～250 g，制作大鼠右側坐骨神經損傷模型，實驗組每天腹腔注射維拉帕米注射液4 mg/kg〔5〕，對照組每日腹腔注射等量生理鹽水。術后第2天隨機分成實驗組和對照組，每組分成4 w、12 w兩個時相，每個時相點30只大鼠。

1.1.2 主要實驗藥品和試劑 鹽酸維拉帕米注射液，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆抗體，免疫組化(SABC法)試劑盒。羥脯氨酸測試盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，生效后俯臥位固定，無菌條件下顯露右側坐骨神經，于梨狀肌下緣1 cm處鋒利刀片橫行切斷坐骨神經，以神經外膜上的血管走行為標記，立即用9-0無損傷縫合線行神經外膜端端吻合術，吻合口均勻縫合6針。逐層閉合創口，術后第2天大鼠清醒后進行隨機分組。

1.2.2 取材 術后4 w和12 w取材。引頸處死大鼠后暴露雙側坐骨神經，并以吻合口為中心切取右側坐骨神經約1.5 cm，同時切取左側相同區段正常神經作為對照，分別置于10%甲醛中固定。

1.2.3 觀察指標 (1)Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學染色:神經標本固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4μm，采用SABC法，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆抗體一抗濃度均為1∶50，染色方法按照試劑說明書步驟進行，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，脫水封片。(2)羥脯氨酸消化法測定膠原蛋白含量:切取坐骨神經損傷最明顯處神經瘢痕0.4 cm，拆去尼龍無損傷縫合線，同時切取對側同區段正常神經0.4 cm，分別準確稱取待測神經組織的重量。稱重后放在勻漿管口部，用小剪刀剪碎，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，勻漿時間10 s/min，間隙30 s，連續3～5次，在冰水中進行。勻漿后以3 500 r/min離心10 min，取上清0.1 ml加0.4 ml生理鹽水，稀釋成2%的組織勻漿2份待測。取1份勻漿按考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書配制空白管、標準管、測定管，靜置10 min，595 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測各管OD值。并按下面公式計算蛋白含量:

取另一份勻漿液按羥脯氨酸測試盒說明書消化步驟分別配制空白管、標準管、測定管，混勻，37℃水浴3 h，然后按說明分別向3管添加相應試劑，混勻，60℃水浴15 min，流水冷卻后，3 500 r/min，離心10 min，取上清在550 nm處，1 cm光徑，蒸餾水凋零，測各管OD值。

按上式計算組織中羥脯氨酸量，并按公式:膠原蛋白含量=羥脯氨酸量÷13.4%，計算出組織中膠原蛋白含量。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據以x±s表示，不同組間、同組在不同時相點的比較均采用成組t檢驗。

2 結果

2.1 Ⅰ、Ⅲ型膠原的免疫組織化學觀察 鏡下可見膠原纖維被染成棕黃色。實驗組吻合口處Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維增生少，神經纖維排列整齊，空泡變性少見。對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原在吻合口處有明顯增生，有的甚至形成膠原團塊，神經纖維稀疏，組織間存在廣泛空泡變性。圖像分析表明對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維在4 w、12 w兩個時相點上均比實驗組和正常神經增生明顯，差異具有統計學意義。實驗組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量與正常神經比較差異不明顯(P＞0.05)。見表1，圖1。

表1 神經吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維百分比(x ±s，n=10，%)

圖1 兩組12 w時吻合口處膠原纖維(×100，縱切)

2.2 羥脯氨酸消化法測定損傷處神經組織中膠原蛋白含量在正常神經中膠原蛋白含量約為(3.68±0.28)μg/mgprot，實驗組12 w時膠原蛋白含量為(3.99±0.34)μg/mgprot，與正常神經膠原蛋白含量無明顯差異(P＞0.05，t=1.87)。對照組12 w時膠原蛋白含量為(5.32±0.65)μg/mgprot，明顯高于正常神經和實驗組12 w時膠原蛋白含量，差異均具有統計學意義(P ＜0.01)。

3 討論

3.1 鈣通道阻滯劑抑制瘢痕的作用機制 1992年Lee等首先報道了鈣通道阻滯劑在臨床上瘢痕治療中的作用，Jamil等〔3〕將其用于治療陰莖硬化纖維病，取得良好效果，Steinleitner等〔4〕通過動物實驗發現鈣通道阻滯劑對腹部手術后粘連有預防作用。Diegelmann等〔6〕發現鈣通道阻滯劑能夠破壞細胞骨架，阻斷高爾基體來源的囊泡移動，結果導致細胞內原膠原增加。Lee等〔7〕發現維拉帕米能抑制原膠原蛋白等大分子分泌到細胞外，Michael等〔8〕進一步研究發現蓄積在細胞內的原膠原蛋白又反饋性的抑制原膠原基因的轉錄，從而減少了膠原蛋白的生成，其效應有濃度依賴性。至目前為止，雖然對于鈣通道阻滯劑發揮抑制瘢痕作用的機制尚存在爭議，但原膠原蛋白等大分子的分泌是鈣依賴過程已經成為人們的共識。

3.2 鈣通道阻滯劑抑制神經瘢痕的機制探討 鈣通道阻滯劑在治療其他組織的瘢痕和纖維化疾病的研究中已經取得了可喜的進展，而鈣通道阻滯劑對神經瘢痕的形成過程有無抑制作用國內外尚無相關報道。研究發現創傷性神經瘢痕同其他組織修復時的瘢痕在組織學上很相近，也主要是以成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質在損傷處的異常沉積為特征。所以推測，鈣通道阻滯劑也應該能夠抑制神經瘢痕的形成，這正是本研究觀察的主要目標及意義所在。本實驗采用Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色觀察了神經瘢痕中兩種主要膠原纖維的分布。Ⅰ、Ⅲ型膠原的物理性質有著很大差別，Ⅰ型膠原纖維粗大，抗張力強，主要分布在肌腱、骨骼、牙本質等堅硬組織中;而Ⅲ型膠原纖維細小，抗張力小，主要分布在胚胎皮膚、血管、胃腸道等處。在正常神經中，Ⅰ型膠原主要分布在神經外膜，束膜和內膜也有少量分布;Ⅲ型膠原在三層膜中都有分布，但主要分布在神經束膜和內膜〔9〕。本實驗觀察到神經損傷后Ⅰ型膠原纖維在神經束膜、內膜均有明顯增生，甚至形成膠原團塊，因為Ⅰ型膠原纖維粗大，其增生雖然增加了組織的抗張性，但對神經組織內的髓鞘、軸突和微血管可能造成壓迫，并使新生的神經纖維再次脫髓鞘，組織間存在廣泛空泡變性。經維拉帕米干預后，Ⅰ、Ⅲ型膠原在神經束膜內膜沉積減少，同時組織內血管分布增多，髓鞘變性減少，說明維拉帕米可能通過抑制膠原的沉積，改善神經再生的組織環境，間接促進了神經恢復。

1 吳 斗，劉 強，龔 強，等.透明質酸對外周神經修復后瘢痕形成的預防作用研究〔J〕.中華創傷雜志，2005;21(12):925-9.

2 Atkins S，Smith KG，Loescher AR，et al.Scarring impedes regeneration at sites of peripheral nerve repair〔J〕.Neuroreport，2006;17(12):1245-9.

3 Rehman J，Benet A，Melman A.Use of intralesional verapamil to dissolve peyronie's disease plaque:a long-term single-blind study〔J〕.Urology，1998;51(4):620-6.

4 Steinleitner A，Kazansky C，Lambert H.Calcium channel blockade prevents postsurgical reformation of adnexal adhesion in rabbits〔J〕.Obstet Gynecol，1989;74(5):796-8.

5 熊 業，陳宗榮，程天民.維拉帕米對放燒復合傷大鼠心肌線粒體功能的保護作用〔J〕.第三軍醫大學學報，1995;17(2):93-5.

6 Diegelmann RF，Peterkofsky B.Inhibition of collagen secretion from bone and cultured fibroblasts by microtubular disruptive drugs〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1972;69(14):892-6.

7 Lee RC，Ping JA.Calcium antagonists retard extracellular matrix production in connective tissue equivalent〔J〕.JSurg Res，1990;49(5):463-6.

8 Roth M，Eickelberg O，Kohler E.Ca2+channel blockers modulate metabolism of collagens within the extracellular matrix〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93(11):5478-82.

9 陳振兵，洪光祥.鼠神經膠原的免疫組織化學與電鏡觀察〔J〕.中華手外科雜志，1997;13(1):53-60.