電針對擬老年性癡呆大鼠學習記憶功能和海馬CA1區突觸可塑性的影響

王 威 唐 偉 孫忠人

(大連大學附屬中山醫院康復醫學科，遼寧 大連 116001)

迄今為止，治療老年性癡呆(AD)尚無特效藥物。長期以來針刺治療AD的實驗研究多局限于單因素的動物模型，不能充分體現AD與衰老及多種環境因素相關的病理機制。本研究通過建立一個集衰老、鋁中毒以及膽堿能系統損害等多因素的AD動物模型，采用行為學、免疫組化和圖像分析技術，研究針刺對AD大鼠學習記憶、海馬CA1區超微結構和突觸素表達的影響，探討針刺改善AD大鼠學習記憶功能的中樞機制，為針刺治療AD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與設備 健康雄性Wistar大鼠50只，由大連醫科大學動物實驗中心提供(許可證號為遼實動質字〔2000〕028號)。自由進食，每日照明12 h，室溫(23±2)℃。JEM-1220型透射電子顯微鏡;LKB-V超薄切片機;跳臺儀(大連大學附屬新華醫院提供);圖像分析系統(Image Pro Plus 6.0，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 按照體重將50只大鼠隨機分成4組:空白對照組(10只)、空白電針組(10只)、模型組(15只)和模型電針組(15只)。全部實驗動物用相同的飼料喂養，整個喂養過程中所使用的器皿均為非鋁制品。①空白對照組:予常規飲水和飼料，并胃飼及腹腔注射與模型組等容量的生理鹽水;②空白電針組:在給予生理鹽水同時進行電針治療;③模型組:東莨菪堿(SCOP)+AlCl3+D-半乳糖(D-gal);④模型電針組:在造模同時進行電針治療。

1.2.2 穴位選擇 ①百會:頂骨正中;②大椎:第七頸椎棘突與第一胸椎間，背部正中;③腎俞:第二腰椎下兩旁;④足三里(后三里):膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處。

1.2.3 針刺方法 用0.25 mm×15 mm毫針針刺大鼠“百會”穴，向前斜刺約3 mm，“大椎”穴，直刺約4 mm，雙側“腎俞”穴，直刺進針5 mm，雙側“足三里”穴，直刺進針5 mm。連接KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀，疏波，頻率為2 Hz，電壓為2 V，強度以肢體輕微抖動為度;1次/d，時間20 min。10 d為1個療程，間歇1 d，治療3個療程后進行行為學測試。

1.2.4 大鼠行為學檢測 跳臺實驗〔1〕:電針治療結束后進行跳臺實驗;實驗裝置體積為15 cm×30 cm×30 cm的被動條件反射箱，箱底鋪以銅柵，銅絲直徑為2 mm，間距為5 mm;電流強度由一個可調變壓器控制，通以36 V電流，箱內右后側放置一個高和直徑均為4.5 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區。將大鼠放入箱中自由活動3 min，熟悉環境，然后箱底通以電流，其正常反應是跳上平臺以躲避傷害性刺激;記錄大鼠首次跳到銅柵上的時間(即潛伏期)和5 min內大鼠跳到銅柵上的次數(錯誤次數)，以此作為學習成績。24 h后重復試驗，記錄其第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內的錯誤次數，從而反映大鼠的記憶保持能力。

1.2.5 海馬區CA1區蘇木素-伊紅(HE)染色和突觸素表達檢測 用10%水合氯醛將大鼠麻醉，于冰臺上迅速取出腦組織，分離海馬，切片并置于10%中性甲醛溶液中固定，4℃過夜，常規梯度脫水，透明，石蠟包埋，切片(4μm)。用HE染色光鏡下觀察海馬CA1區組織形態學變化。用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶(SP)免疫組化方法染色，石蠟切片置于二甲苯脫蠟水化，加入3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性。滴加一抗(兔抗大鼠突觸素濃度1∶150)，4℃孵育不少于18 h，加入生物素二抗，在37℃孵育20 min，DAB顯色，HE輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。在顯微鏡(Olympus，BX60，Japan)下觀察突觸素蛋白的表達，用圖像分析系統(Image Pro Plus 6.0，美國)測量其平均灰度值。

1.2.6 電鏡觀察海馬CA1區超微結構 各組分別取5只大鼠，麻醉，暴露心臟，灌注4%多聚甲醛與1%戊二醛，取腦，分離并留取海馬CA1區，1%鋨酸4℃冰箱中固定1～2 h，逐級丙酮脫水，浸透2 h，Epon812包埋液，LKB型超薄切片機超薄切片(500?～800?)，醋酸鈾染，枸櫞酸鉛染。電鏡下觀察海馬CA1區超微結構。每只大鼠觀察1張銅網，每張銅網連續拍攝10張照片，底片放大2.5萬倍印相。借助圖像分析系統和攝錄儀測量突觸的面數密度、面積密度和體積密度。面數密度即參照系截面單位面積內顆粒截面數目，單位為個/μm2。面積密度表示膜面積相對于參照系體積的多少，單位為μm2/μm3。體積密度表示結構體積在參照系體積中相對大小的參數。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據以x±s表示，各組間各參數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 實驗動物數量 納入動物50只，48只大鼠進入結果分析，模型組和模型電針組各有1只動物因胃飼誤入氣管致死。

2.2 跳臺實驗(潛伏期、錯誤次數)結果 與空白對照組比較，模型組大鼠出現明顯的學習記憶功能障礙，潛伏期縮短，錯誤次數增加(P＜0.01)。與模型組比較，電針治療能夠改善大鼠的學習和記憶功能，延長潛伏期和減少錯誤次數(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組跳臺實驗結果(x±s)

2.3 海馬CA1區HE染色結果 空白對照組和空白電針組海馬CA1區神經細胞排列整齊緊密，形態完整，胞漿豐富，胞核飽滿，核仁清晰。模型組神經細胞缺失較多，殘留的神經細胞排列松散不規則，邊界模糊，邊緣出現空泡，有的胞核消失。模型電針組神經元數目較模型組明顯增多，神經元胞漿豐富，核仁清晰。見圖1。

2.4 海馬CA1區突觸素表達結果 空白組、空白電針組海馬CA1區突觸素表達較多，二者之間無顯著性差異(P＞0.05)。模型組海馬CA1區突觸素表達減少，與空白組相比有顯著性差異(P＜0.01)。模型電針組與模型組比較，突觸素表達增加(P ＜0.01)。見表2，圖2。

圖1 海馬CA1區HE染色

圖2 海馬CA1區突觸素表達

2.5 海馬CA1區突觸電鏡結果 空白組、空白電針組神經氈內可見大量突觸，突觸前后成分境界清楚，輪廓完整，突觸前終末內突觸小泡多，分布密集均勻，多為圓形清亮小泡。模型組神經氈內突觸數目減少，突觸前膜不清晰，突觸間隙模糊，前、后膜不明顯，突觸小泡明顯減少甚或消失，突觸前、后膜破壞變薄，典型的突觸結構已不存在。模型電針組神經氈內可見較多突觸，突觸前終末內突觸小泡也較多，可見較多圓形清亮小泡，密集分布，突觸前、后膜較模型組增厚，與空白組接近。見圖3。

圖3 海馬CA1區突觸超微結構

表2 各組大鼠海馬CA1區突觸素表達和超微結構各參數比較(x ± s，n=5)

3 討論

中醫防治AD主要是從整體的角度去分析這一病證的內在實質，針對某一病證個體做出客觀的判斷，實施針對性很強的防治措施。本研究所選百會穴為髓海的上俞穴，治療髓海不足健忘、老年性癡呆的要穴;大椎穴是手足六陽經的交會穴，為“諸陽之會”;百會穴和大椎穴均為督脈之穴，二穴相配可通調諸經，激發經氣，增強各臟腑經絡之功效，使腦髓得氣血榮養，促使陰陽平衡。腎俞為膀胱經穴位，可益腎填髓充腦，《靈樞·經脈》言“膀胱足太陽之脈，起于目內眥，上額交巔。其直者，從巔入絡腦”。足三里為強壯保健的要穴，有延緩衰老的作用。如此配穴體現了配穴原則中的局部與遠道取穴的結合運用。數穴合用，臨床上取得較好療效。

有研究表明，D-gal致亞急性衰老模型、慢性鋁中毒和SCOP中毒都能模擬老年癡呆樣改變〔2～4〕，三種因素復合的模型能更貼近AD復雜的病因和病理變化過程，在這種模型上研究針刺作用效果所得出的結論可能更加可靠。從本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素AD大鼠模型行為學觀察表明，大鼠跳臺測試的觸電潛伏期及5 min錯誤次數與對照組比較均有明顯改變。模型組海馬區形態學可見神經細胞缺失，神經氈內突觸數目減少，突觸小泡明顯減少甚或消失，典型的突觸結構已不存在，與臨床上AD的病理變化相似。

突觸變化是學習記憶形成的一個重要形態學和功能學基礎。突觸喪失會中斷很多功能通路的聯系，引起多方面的功能障礙，尤其是認知和記憶功能障礙。Selkoe〔5〕通過顳、額葉皮質活檢研究發現，早期AD患者皮質的突觸密度減和神經元的突觸數目減少均減少。突觸素是一種與突觸結構和功能極為相關的膜蛋白，參與突觸小泡膜與突觸前膜的融合和神經遞質的釋放，是突觸重建的重要標志〔6〕。研究發現突觸素免疫活性與AD患者的認知障礙程度相關〔7〕，國內學者洪岸〔8〕用單克隆抗突觸素抗體免疫組化染色，結果表明老年損害組大鼠海馬、齒狀回突觸素免疫反應產物灰度較青年組、老年正常組明顯降低;老年大鼠平均逃避潛伏期與其海馬結構突觸素免疫反應產物灰度呈顯著負相關，提示老年學習記憶能力與海馬結構突觸素有密切聯系。而本實驗模型組潛伏期縮短，錯誤次數增多，海馬CA1區突觸素表達減少。突觸素是在神經元胞體合成，在囊泡中被運至軸突終末。突觸素表達減少的可能原因:①軸突終末丟失;②突觸素合成減少。

有研究表明針刺具有拮抗衰老過程中的病理生理變化〔9～11〕。本實驗針刺治療組海馬CA1區突觸素表達明顯多于模型組，提示針刺促進了海馬區突觸素表達。而電鏡下觀察到電針組海馬區神經氈內可見較多突觸，突觸前終末內突觸小泡也較多，可見較多圓形清亮小泡密集分布，與突觸素免疫反應結果相吻合。針刺改善AD大鼠學習記憶能力的機制，可能是針刺刺激增加了大鼠由于造模而損傷壞死的邊緣區的記憶突觸，即膽堿能突觸，使其密度增加，從而使殘存的神經元發揮更大的作用，使記憶突觸間隙變窄，得以加速突觸間的傳導功能;同時腦內存在一些神經傳導的旁路，針刺刺激可引起神經沖動，經外周神經傳導至中樞神經系統，經平時少起作用的旁路刺激大腦皮層，從而引起壞死邊緣區突觸數目和結構的改變;突觸后膜致密物質厚度增加，可能與某些酶及其底物蛋白的磷酸化過程引起其分子構型改變有關，這可能是功能變化的形態學基礎。因此，可以推測針刺是通過促進海馬內突觸重建，提高突觸素的表達，從而改善AD大鼠的學習記憶能力，這可能是針刺改善AD大鼠模型智能障礙的機制之一，也為針刺治療AD提供了思路。

1 徐淑云.藥理實驗方法學〔M〕.第2版.北京:人民衛生出版社，1994:660.

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3 朱清華，熊希凱，章錫平，等.鋁對大鼠學習記憶神經遞質腦結構形態的損害〔J〕.同濟醫科大學學報，1992;21(增):8-10.

4 李 斌，郭德玉，李 林.三種老年癡呆動物模型行為學比較〔J〕.中國實驗動物學報，1999;7(1):37-42.

5 Selkoe DJ.Alzheimer's disease is a synaptic failure〔J〕.Science，2002;298(5594):789-91.

6 Terry RD，Masliah E，Saimon DP，et al.Physical basis of cognitive alter-nations in Alzheime's disease:synapse loss is the major correlate of cognitive impairment〔J〕.Ann Neurol，1991;30(5):572-80.

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8 洪 岸.老年大鼠學習記憶減退與海馬結構的突觸素改變〔J〕.解剖學報，1996;27(2)164-8.

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10 朱書秀，孫國杰.電針對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶能力及海馬區膠質細胞的影響〔J〕.中國針灸，2009;29(2):133-6.

11 Xue WG，Ge GL，Zhang Z，et al.Effect of electroacupuncture on the behavior and hippocampal ultrastructure in APP 695 V 717 I transgenic mice〔J〕. 針刺研究，2009;34(5):309-14.