自體骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死后心衰家兔炎性因子表達的影響

喬建晶 李樹仁 胡 煒 王天紅 劉東霞 荀麗穎 郝淸卿 吳 迪 董 潔 齊曉勇

(河北省人民醫院，河北 石家莊 050051)

急性心肌梗死(AMI)往往伴隨強烈的免疫炎癥反應，是損傷部位修復機制的重要調控因素之一。免疫炎癥反應過度激活將導致心肌進一步損傷，推動心室重塑的發生和發展〔1〕。多種抗炎藥物已被用于AMI治療，但臨床研究尚未達到預期療效。采用甲潑尼龍抑制心肌梗死后炎癥反應，但患者心律失常發生率增加，梗死面積擴大，甚至增加心臟破裂的發生率。非甾體類抗炎藥物治療AMI的相關研究也與預期不符。兩項大的臨床試驗RENAISSANCE和RECOVER結果顯示:重組TNF受體融合蛋白依那西普(Etanercept)對心力衰竭患者的住院率和病死率無明顯改善。實驗研究顯示BMSCs移植可以抑制AMI后免疫炎癥反應，延緩心肌梗死后心室重塑〔2，3〕，可能與調節相關炎性細胞因子的表達有關。本實驗觀察BMSCs移植對心肌梗死后心衰家兔炎性細胞因子表達的影響，以揭示其治療心肌梗死的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 河北醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK冀2008-1-003)5月齡健康雄性新西蘭白兔34只，體重1.8～2.3 kg，隨機分為假手術組、AMI后心衰模型組、BMSCs移植組。組間體重無顯著差異。

1.2 主要試劑 胎牛血清(美國hyclone公司);低糖DMEM培養基(美國 hyclone公司);Percoll原液(美國Pharmacia公司);DAPI(瑞士Roche公司);5-氮胞苷(美國SIGMA公司)。

1.3 BMSCs的分離、培養、誘導及標記 在股骨處穿刺抽取3～5 ml骨髓，用Percoll分離液(密度1.073 g/ml)分離骨髓單個核細胞，將分離的細胞懸液置于含10%胎牛血清的 DMEM培養基中，放入37℃，5%CO2飽和濕度孵箱中培養。3～5 d首次換液，以后每3或4天換液1次，14～21 d細胞生長融合80%以上后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代培養。于移植前1天用含5-氮胞苷(10μmol/L)誘導培養基繼續培養24 h。移植前 2 h用含二脒基苯基吲哚(DAPI)(濃度50μg/ml)標記培養基培養2 h。最后收集1×107BMSCs，用DMEM濃縮至1 ml，置于冰上(不超過1 h)，移植備用。

1.4 兔AMI后心衰模型的建立 稱重后，兔仰臥于手術臺，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉，剪除胸毛、消毒鋪無菌洞巾，沿胸骨正中線第2，3肋間稍偏左做長約3 cm切口，分離肋間肌、剪斷肋骨、剪開心包暴露心臟，用6/0醫用無損傷縫線穿過左冠狀動脈前降支深部，小心打結并觀察心電圖動態變化。心電圖可見相應導聯ST段抬高，同時肉眼觀察結扎區域心肌變白為結扎成功，逐層關胸，縫合切口。術后3 d肌注青霉素80萬U預防感染。術前及術后2 h記錄體表心電圖。1.5 細胞移植 AMI術后14 d，仍以3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈麻醉兔二次開胸，再次行胸骨左側切口打開胸腔，暴露心臟，選取心肌梗死周邊區域4個注射點，BMSCs組注射BMSCs懸液，AMI后心衰模型組注射 PBS液。每點注射0.25 ml，注射位置以6/0手術線標記。術后獨籠精心飼養。

1.6 超聲心動圖左心功能測定 采用美國惠普公司5500型彩色多普勒超聲心動圖儀在術前、心梗后7 d、細胞移植后28 d分別由同一專科醫生進行超聲心動圖檢測。重點測算左室舒張末內徑(EDD)、左室射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)，取3次測量平均值，由超聲心動圖醫生進行操作。

1.7 取材 各組動物飼養至細胞移植后4 w，在全身麻醉下再次開胸，心內注射10%氯化鉀2 ml使心臟停搏于舒張期，迅速取下心臟，冰鹽水沖洗干凈，在相應梗死周邊區切取標本，置入液氮罐冷凍保存備用。

1.8 ELISA法測血清炎性因子 分別于術前、心梗后7 d、細胞移植后28 d(處死前)經耳緣靜脈抽血2～3 ml，避免溶血，抗凝劑用EDTA，2 000 r/min離心8 min，取上清－20℃保存，采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α、CRP的濃度。試劑盒由美國ADL公司提供，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.9 實時定量PCR法檢測心肌組織NF-κB、IL-6、TNF-αmRNA表達 將心肌組織按RNA試劑盒(Invitrogen公司產品)說明書提取RNA。42℃反轉錄(反轉錄試劑盒:Promega，USA)50 min，95℃ 5 min滅活反轉錄酶。Syber Green熒光定量PCR檢測(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits，ABI)。儀器型號:ABI 7300 Real-Time PCR System，美國ABI公司。PCR熱循環參數:96℃ 4 min，然后三步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，40個循環，于每個循環的第3步即:72℃ 30 s收集熒光信號。實時熒光定量PCR結果分析:擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。引物序列:兔 NF-κB，121 bp，上游引物 5'-TACGGCTTCCCACACTATGG-3'，下游引物 5'-TCACAACATCCAGGGTCAGT-3';兔 IL-6，79 bp，上游引物 5'-GCCTGCTGAGAATCACTTCG-3'，下游引物5'-TCGTCACTCCTGAACTTGGC-3';兔 TNF-α，148 bp，上游引物5'-AGTAGCAAACCCGCAAGTG-3'， 下 游 引 物 5'-GCTGAAGAGAACCTGGGAGT-3';兔 GAPDH，92 bp，上游引物 5'-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下 游 引 物 5'-CACTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'。

1.10 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件包，計量資料以x±s表示。多組資料之間的比較采用單因素方差分析，多組間均數對比采用q檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs形態觀察 大部分BMSCs于12 h貼壁，72 h可見貼壁生長以分散、克隆集落方式增殖，少量細胞拉長呈紡錘形緊貼培養瓶底部生長繁殖。5～7 d后細胞開始快速增殖，集落逐漸增大。11～14 d細胞集落間出現相互融合，細胞鋪滿單層，呈旋渦狀排列。大部分呈長梭形，少數三角形、多角形。密集處中心的細胞由多邊形轉變為梭形。胞核較大，多為卵圓形，也有圓形、不規則形，其中可見處于分裂期的核仁，胞體肥大，胞質豐富，大多數細胞有偽足。見圖1。

2.2 熒光顯微鏡下觀察DAPI標記的BMSCs 經DAPI標記2 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到DAPI標記的BMSCs。細胞移植28 d后，處死家兔后，取梗死周邊區域心肌組織，經冰凍切片機切片后，在熒光顯微鏡下可觀察到的經DAPI標記的移植BMSCs。見圖 2。

2.3 家兔心功能檢測結果 術前各組EDD、EF、FS均無顯著差異。AMI后心衰模型制作7 d，AMI后心衰模型組、BMSCs組EF值比正常對照組顯著降低(P＜0.05);AMI后心衰模型組和BMSCs組EF值差異不顯著。細胞移植后28 d，正常對照組、BMSCs組EDD均明顯低于AMI后心衰模型組(P＜0.05)，EF及FS均明顯高于AMI后心衰模型組(P＜0.05)。差異有統計學意義，見表1。

2.4 血清炎性因子檢測結果 術前各組炎性因子無顯著差異。術后7 d，與正常對照組相比AMI后心衰模型組、BMSCs組的血清 IL-6、TNF-α、CRP的濃度均顯著增加(P ＜0.05)，但AMI后心衰模型組和BMSCs組之間差異不顯著。細胞移植后28 d，BMSCs組血清 IL-6、TNF-α、CRP 的濃度比 AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05);正常對照組略低于BMSCs組，但無顯著差異。見表2。

2.5 心肌組織炎性因子PCR檢測結果 細胞移植后28 d，BMSCs組梗死邊緣區心肌組織IL-6、TNF-αmRNA表達比AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05)。見表3。

2.6 心肌組織NF-κB的PCR檢測結果 與正常組相比AMI后心衰模型組、BMSCs組的心肌梗死邊緣區的NF-κB均顯著增加(P＜0.05)，BMSCs組比AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05)。見表3。

表1 兔心功能測定(x ± s，n=8)

表2 兔血清炎性因子測定結果(x ± s，n=8)

表3 兔移植28 d心肌組織炎性因子PCR檢測RQ值(x ± s，n=8)

圖1 BMSCs 20 d(×200)

圖2 DAPI標記后2 h及細胞移植28 d后心肌組織BMSCs

2.7 心功能與心肌組織炎性因子及NF-кB的相關性 細胞移植后28 d時，EF與血清炎性因子呈負相關(CRP:r=－0.605，P=0.002，Y=93.959 －4.344X;TNF-α:r= －0.425，P=0.039，Y=85.346－0.122X;IL-6:r= －0.475，P=0.025，Y=86.967 －0.085X);與心肌組織炎性因子呈負相關(TNF-α:r=－0.592，P=0.002，Y=71.206 － 2.887X;IL-6:r= －0.512，P=0.011，Y=70.392－1.509X);與心肌組織 NF-κB呈負相關(r=－0.866，P=0.001，Y=71.621－10.039X)。其中 Y 代表 LVEF值，X代表各個炎性因子。

3 討論

骨髓干細胞用于心肌梗死治療研究已經成為心血管疾病領域的研究熱點。動物研究幾乎一致顯示骨髓干細胞可以明顯改善梗死心臟心功能，抑制心室重塑〔4，5〕，相關的臨床研究也得到了類似的結果〔6〕。但由于目前臨床研究的樣本量較小，另外無法完全做到隨機對照，再加上目前干細胞治療心肌梗死的確切機制并不清楚，因此骨髓干細胞到底能否治療心肌梗死尚未得到完全肯定。目前認為其機制可能與心肌和血管再生、抑制心肌細胞凋亡以及旁分泌機制有關〔7〕。BMSCs治療AMI的機制較復雜，除了目前的幾種機制外，可能存在有其他未知機制。本研究結果顯示:BMSCs移植可以抑制NF-κB表達，下調炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和CRP)的表達，可以明顯改善心肌梗死后心功能，延緩心肌梗死后向心力衰竭方向的進展。BMSCs具有獨特的免疫學特性，移植到機體后可以調節受體的免疫炎癥反應〔8〕。由于心肌梗死后伴隨的免疫炎癥反應在隨后的梗死后心室重構過程中起著重要的推動作用〔9〕。故可以認為心肌梗死后減輕免疫炎癥反應可以抑制心室重構，改善心功能。心肌梗死后伴隨一定程度的免疫炎癥反應，而且免疫炎癥反應在心室重構進展中起著重要的推動作用，心肌梗死后調節免疫炎癥反應可能成為抑制心室重塑的新靶點。NF-κB是與炎癥反應有關的即早基因的表達調控關鍵因子之一。NF-κB與抑制蛋白I-κB結合在胞漿中呈非活化狀態，在刺激因子作用下，與I-κB解離而活化，并迅速核移位，與特異性κB結合而啟動靶基因轉錄，分泌白細胞介素、腫瘤壞死因子、細胞黏附分子、干擾素等炎性介質，產生急性炎癥反應。NF-κB能在轉錄水平激活炎性細胞因子，而某些細胞因子如TNF-α、IL-6又可進一步激活 NF-κB，如此循環產生放大作用〔10〕。本研究發現，BMSCs移植后，可顯著降低梗死邊緣區NF-κB的表達，進而調控炎癥反應有關的即早基因的表達，下調了炎性因子TNF-α、IL-6和CRP的表達，減輕炎癥反應對心肌的損傷，從而減輕心肌梗死后心室重塑。

TNF-α和IL-6作為促炎細胞因子對心肌細胞具有毒性作用，可以抑制心肌收縮功能，誘導心肌細胞凋亡，推動心室重構的進展〔11〕。正常心肌組織很少表達TNF-α和IL-6，而心肌缺血損傷可迅速激發TNF-α和IL-6的高水平表達。動物實驗也證實抑制TNF-α的活性可以明顯減小心肌梗死面積，改善心功能〔12〕。因此，抑制TNF-α和IL-6的表達有助于延緩心肌梗死后心室重構。本實驗結果顯示細胞移植后4 w時，AMI后心衰模型組促炎因子TNF-α和IL-6在梗死區存活心肌內表達明顯增加，而BMSCs移植組明顯降低促炎因子TNF-α和IL-6的表達。從而在一定程度上抑制炎癥反應，延緩心肌梗死后家兔心室重塑，延緩向心力衰竭的發展。

CRP是由白細胞介素-6及TNF等細胞因子誘導的在肝臟合成的一種急性時相反應蛋白。機體在感染、組織損傷等應激情況下會產生急性時相反應，此時IL-6，TNF等細胞因子分泌增多，肝臟合成的CRP明顯增加。CRP在正常人群含量極低，其水平增高被認為機體內存在炎癥反應。采用高靈敏度的系統來檢測CRP已經被多項前瞻性研究證實是未來發生心血管事件的預測指標。本實驗研究發現BMSCs可以減少CRP的合成，減輕炎癥反應。本研究結果提示BMSCs可能通過抑制NF-κB活性而下調炎性細胞因子(CRP、TNF-α和 IL-6)表達，從而也阻斷了NF-κB與炎性細胞因子的相互激活和促進，從而減輕炎癥反應，減輕心肌梗死后左室重塑，延緩心肌梗死后向心力衰竭的進展。因此作者推測BMSCs治療心肌梗死可能部分歸功于免疫炎癥調節機制，BMSCs移植有望成為心肌梗死后免疫調節治療的策略之一。

BMSCs移植后通過免疫調節發揮作用〔13〕。BMSCs表達的表面分子可以與T細胞發生相互作用，調節T細胞的生物活性，通過這種免疫調節作用，一方面可以逃避免疫反應對其自身的破壞，另一方面也可以減輕周圍組織中的免疫反應強度，從而在一定程度上保護組織功能。BMSCs的免疫調節作用機制復雜，可能與多種因素有關〔14〕。(1)本身低免疫原性，MSCs表達中等水平的MHC-Ⅰ類分子，從而能被NK細胞赦免;不表達MHC-Ⅱ類分子，故能逃避異原性CD4+T細胞的識別。同時它不表達FAS配體或共刺激分子，因而不能誘導效應T細胞反應;(2)通過分泌可溶性細胞因子(如肝細胞生長因子和TGF-α)，與T細胞直接接觸誘導T細胞活化受阻;通過PGE2和吲哚胺2，3雙加氧酶介導活化NK細胞增殖受抑〔15〕;(3)改變T細胞和DC的表型、功能，研究發現MLR中加入BMSCs后Treg明顯增加;人BMSCs通過細胞間接觸可將APC轉化為半成熟的抑制型DC而誘導外周耐受。另外BMSCs在體外能明顯抑制CD8+T細胞增殖，同時減低Thl而增加Th2。

由于骨髓干細胞移植可能通過定向分化、融合、旁分泌、抑制免疫炎癥反應等作用方式影響梗死區心肌再生和血管形成，因而是一種有前途的研究方向。到目前為止，國內外研究由于移植的細胞類型，途徑，病例數，無嚴格對照，隨訪時間少等諸多原因目前仍存在許多尚待解決的問題。比如是否需要采用動員方案及最佳動員時機，移植細胞是否需要純化，細胞移植的最佳時間點，最佳移植途徑，最佳移植數量，以及是否存在成瘤現象;缺乏干細胞治療的長期資料，細胞移植治療的具體機制等。另外，植入缺血心肌內的BMSCs生存能力差，這也大大限制了它們的修復能力。怎樣有效提高移植細胞的存活，還需繼續努力研究和探索。這些問題都需要我們在進一步的研究實踐中逐漸解決。隨著科技的發展和社會的進步，細胞移植無疑對缺血性心臟病的治療提供了新的手段，并將會產生廣闊的應用前景。

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