CXCL12與CXCR4在膽囊癌中的表達及其意義

呂海濤 王文斌 劉潤田 邊 偉 馬毓梅 張樹斌

(河北醫科大學第二醫院肝膽外科，河北 石家莊 050000)

膽囊癌是一種少見的惡性腫瘤并且預后極差，術后5年生存率是5% ～42.3%，除手術之外缺乏有效的治療手段〔1〕。目前對膽囊癌的惡性生物學行為仍缺乏充分的認識。文獻報道，趨化因子CXCL12與其受體CXCR4所構成的CXCL12-CXCR4生物學軸(CXCL12-CXCR4 biological axis)在多種實體腫瘤的播散和器官特異性轉移中發揮著重要的作用，其在膽囊癌中的表達及其作用機制未見報道。本文利用免疫組化方法，檢測CXCL12與CXCR4蛋白在膽囊癌中的表達，并對其表達意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 材料 我院手術切除病理證實膽囊癌標本44例、10例膽囊腺瘤。44例膽囊癌患者中，男22例，女22例，年齡40～78〔平均(60.7±16.5)〕歲。術前均未作放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。Nevin分期為Ⅰ期3例，Ⅱ期11例，Ⅲ期2例，Ⅳ期7例，Ⅴ期21例;高分化16例，中分化10例，低分化18例;有淋巴結轉移17例;腺癌34例，其他10例。

1.2 試劑 兔抗人CXCL12單克隆抗體為美國RD公司產品，鼠抗人CXCR4單克隆抗體為Abcam公司產品。檢測試劑采用福州邁新生物技術開發有限公司免疫組織化學ElivisionTMplus檢測試劑盒，操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 方法 切片常規脫蠟、水化后，在pH6.0枸櫞酸酸鹽緩沖液中加熱修復15 min，溫度98℃。0.3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min。滴加一抗(CXCL12稀釋濃度為4μg/ml;CXCR4稀釋濃度為5μg/ml工作液)，孵育過夜，滴加聚合物增強劑，室溫下孵育20 min。滴加酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，滴加新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化。用已知陽性切片作對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定 CXCL12和CXCR4陽性細胞均為胞膜和胞質內出現棕黃色著色顆粒，從陽性腫瘤細胞百分數和染色深淺兩個方面評分〔2〕。染色強度通過觀察腫瘤細胞與間質細胞相比較，定為:無著色，0分;淺著色，1分;中等著色，2分;強著色，3分。根據陽性腫瘤細胞占總的觀察細胞的 ＜10%、10% ～49%、50% ～74%、≥75%分別定為0、1、2、3分，兩項最后相加，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.5 統計學分析 采用SPSS11.5統計軟件，計數資料分析應用χ2檢驗;相關性采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 CXCL12與CXCR4在膽囊癌及膽囊腺瘤中的表達及其與病理指標的關系 CXCL12陽性染色定位膽囊癌細胞胞質，呈淺黃色到棕黃色顆粒狀。44例膽囊癌組織中31例CXCL12表達陽性〔70.1%(31/44)〕，而10例膽囊腺瘤組織陽性率為60%，腫瘤組織中CXCL12表達陽性率與膽囊腺瘤組織無顯著差異(P＞0.05)。CXCL12蛋白的表達與膽囊癌的Nevin分期、淋巴結轉移密切相關。見表1，圖1。

CXCR4的蛋白質表達主要定位于膽囊癌細胞胞質，免疫組化染色呈棕黃色。44例膽囊癌組織中28例CXCR4表達陽性〔61.1%(27/44)〕，而10例膽囊腺瘤組織陽性率為20%，腫瘤組織中CXCR4表達陽性率與膽囊腺瘤組織有顯著差異(P＜0.05)。CXCR4蛋白的表達與膽囊癌的Nevin分期有關(P＜0.05)。見表1，圖2。

2.2 膽囊癌組織中CXCL12與CXCR4蛋白表達的相關性CXCL12與CXCR4表達之間的Spearman相關系數r=0.207，P＞0.05，提示CXCL12與CXCR4的表達無相關關系。

表1 膽囊癌中CXCL12與CXCR4表達及其與臨床病理的關系

圖1 膽囊癌細胞CXCL12陽性表達(×400，IHC SP法)

圖2 膽囊癌細胞CXCR4陽性表達(×400，IHC SP法)

3 討論

過去對CXCL12-CXCR4的研究主要集中于免疫學，尤其是在艾滋病病毒(HIV)感染T淋巴細胞機制以及抗HIV藥物的研制。近年來，人們開始研究CXCL12-CXCR4在腫瘤組織中的表達情況。CXCL12與CXCR4所構成的耦聯分子對介導細胞間的信號傳遞與細胞遷移密切相關，故稱為CXCL12-CXCR4生物學軸，兩者的相互作用可以影響腫瘤細胞的定向遷移、增殖等活動，在多種腫瘤如乳腺癌、結直腸癌、口腔鱗癌等的浸潤發展中發揮著重要作用〔3〕。

有報道CXCL12在卵巢癌、胰腺癌、腦膠質瘤等腫瘤中表達〔4〕。在易發生轉移的組織如肺、肝臟、骨骼中亦有表達〔5〕。本文檢測了CXCL12在膽囊癌以及膽囊腺瘤中的表達，發現CXCL12在膽囊癌以及膽囊腺瘤中均有表達，但兩者差異無顯著性。CXCL12蛋白的表達與膽囊癌的臨床分期和淋巴結轉移有關，臨床分期越晚和有淋巴結轉移的腫瘤中CXCL12表達越高，說明CXCL12可能參與了膽囊癌的浸潤轉移過程。

CXCR4(即CD184)是人類腫瘤中最常見的趨化因子受體。多達23種以上的上皮性、間葉性和血液源性腫瘤細胞表達CXCR4，發揮著重要的病理和生理作用。雖然CXCR4表達于各種組織，但在許多正常組織(乳腺、卵巢)〔6〕中不表達或低表達。CXCR4在腫瘤組織中的表達差異導致個體腫瘤的不同發展方向。Balkwill〔7〕等研究認為原發腫瘤灶CXCR4表達陽性腫瘤細胞較陰性者具有更高的轉移潛能，前者可趨向性運動到其他淋巴結及器官，形成特異性轉移灶。本實驗結果提示CXCR4可能在膽囊腺瘤向膽囊癌惡性轉化過程中發揮一定作用。CXCR4蛋白的表達與膽囊癌的臨床分期有關，臨床分期越晚的腫瘤中CXCR4表達越高，說明表達CXCR4的膽囊癌細胞可能向表達CXCL12的肝臟定向遷移，參與了膽囊癌的浸潤轉移過程。

CXCL12-CXCR4在腫瘤組織中發揮著重要的病理和生理作用〔8〕。CXCL12通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號途徑，不僅能促進表達CXCR4的癌細胞順濃度梯度遷移，并且能通過自分泌和旁分泌的方式促進癌細胞生長〔6〕。推測在膽囊癌中CXCL12與CXCR4之間可能并無直接相互調節作用，Schioppa〔9〕研究認為是缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、核轉錄因子(NF-кB)以及腫瘤抑制蛋白(VHL)上調CXCL12及CXCR4的水平。

1 Kohya N，Kitahara K，Miyazaki K.Rational therapeutic strategy for T2 gallbladder carcinoma based on tumor spread〔J〕.World JGastroenterol，2010;16(28):3567-72.

2 魏 梅，梁立治，張昌卿，等.宮頸腺癌細胞CXCR4/CXCL12過表達與淋巴結轉移和慢性炎癥的關系〔J〕.癌癥，2007;26(3):298-302.

3 Muller A，Homev B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis〔J〕.Nature，2001;410(6824):50-6.

4 Koshiba T，Hosotani R，MivamotoY，et al.Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor system in pancreatic cancer:a possible role for tumor progression〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(9):3530-5.

5 Salcedo R，Wasserman K，Young HA，et al.Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells:in vivo neovascularization induced by stromalderived factor-1α〔J〕.Am JPathol，1999;154(4):1125-35.

6 Scotton CJ，Wilson JL，Scott K，et al.Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2002;62(20):5930-8.

7 Balkwill F.Cancer and the chemokine network〔J〕.Nat Rev Cancer，2004;4(7):540-50.

8 Katayama A，Ogino T，Bandoh N，et al.Expression of CXCR4 and its down-regulation by IFN-gamma in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(8):2937-46.

9 Schioppa T，Uranchimeg B，Saccani A，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 by hypoxia〔J〕.J Exp Med，2003;198(9):1391-402.