GC-MS法同時(shí)測(cè)定生鮮乳中三聚氰胺及其類(lèi)似物的研究

浙江省飼料監(jiān)察所 朱聰英 應(yīng)永飛 羅成江 周 煒陳慧華 韋敏玨 林仙軍

三聚氰胺是一種重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺樹(shù)脂，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。2008年三鹿嬰幼兒奶粉事件將三聚氰胺與食品安全，特別是乳品安全聯(lián)系到了一起。三聚氰胺本身的毒性較低，而三聚氰胺與三聚氰酸同時(shí)攝入體內(nèi)，就會(huì)產(chǎn)生很?chē)?yán)重的后果。二者能夠依靠分子結(jié)構(gòu)上的羥基與氨基之間形成水合鍵，生成不溶于水的三聚氰胺氰尿酸鹽，能在腎小管中沉淀從而形成腎結(jié)結(jié)石（Heller和 Nochetto，2008）。因此，同時(shí)檢測(cè)乳品中三聚氰胺及其類(lèi)似物比單純檢測(cè)三聚氰胺更有實(shí)際意義。目前國(guó)內(nèi)乳品中三聚氰胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)建立，但有關(guān)三聚氰胺及其類(lèi)似物同時(shí)檢測(cè)的研究較少。

目前較常見(jiàn)的以三聚氰胺（MEL）、三聚氰酸（CYA）、三聚氰酸一酰胺（AMD）、三聚氰酸二酰胺（AMN）為目標(biāo)物，三聚氰胺檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫法 （Lutter等，2011），高效液相色譜法（GB/T 22388-2008； Yu 等，2010）、 氣相色譜-質(zhì)譜法 （Miao等，2009）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Anderson 和 Turnipseed，2008；Michael 等 ，2007）。本研究建立了氣相色譜－質(zhì)譜法 （GCMS），另外對(duì)生鮮乳中三聚氰胺及其類(lèi)似物進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。同時(shí)，為了提高定性和定量的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)采用13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA為內(nèi)標(biāo)，提高了定性和定量的準(zhǔn)確性。并對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜法的回收率和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 GC6890N-5973氣相色譜-質(zhì)譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)安捷倫（Agilent）公司，配MSD ChemStation工作站，NIST2.0a譜庫(kù)；Sigma 3 k18冷凍離心機(jī)；MS2 minishaker漩渦混勻器；METTLER AG-285電子天平；氮吹儀。

1.2 材料與試劑 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于 98.0%；內(nèi)標(biāo)物13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA 購(gòu)自 Cambridge Isotope Laboratories Inc.，均為 100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），美國(guó)SUPELCO公司提供；吡啶：色譜純，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱(chēng)取三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺各10 mg于100 mL容量瓶中，三聚氰胺、三聚氰酸用水溶解后定容，三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺用2%氨水溶液溶解后定容，為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于0℃冰箱中保存。分別吸取適量的各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液置于同一容量瓶中，用甲醇溶解后定容，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度即可。內(nèi)標(biāo)溶液配置成 10 μg/mL的13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度80℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至280℃保持5.0 min；進(jìn)樣口溫度280℃；載氣（高純氦）流速：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；溶劑延遲時(shí)間6 min；采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 樣品處理

1.5.1 試樣提取 稱(chēng)取生鮮乳2.0 g（精確到0.01 g），置50 mL聚丙烯離心管中，加內(nèi)標(biāo)工作液100 μL；加提取液（乙腈∶水∶二乙胺=5∶4∶1，V/V/V）17.0 mL、飽和乙酸鉛溶液1.0 mL，10000 r/min以上均質(zhì)60 s，加蓋，于超聲波清洗器中超聲提取20 min；取出離心管，冷卻后8,000 r/min離心10min，取上清液1.5 mL至2.0 mL離心管中，14000 r/min高速離心30 min，再取上清液0.5 mL至5 mL具塞玻璃試管中，50℃氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔飩溆谩?/p>

1.5.2 試樣衍生和檢測(cè) 殘余物中加入吡啶100 μL和衍生化試劑100 μL，加塞后于渦旋混合器充分混勻，在75℃的烘箱中恒溫衍生60 min，取出后冷卻，加吡啶0.3 mL溶解供GC-MS分析。另取三聚氰胺及其類(lèi)似物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，加內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，加空白樣品提取液0.2 mL后，氮?dú)獯蹈桑c試樣同步進(jìn)行衍生化。

1.6 結(jié)果計(jì)算 以峰面積按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)定量，標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣液中被測(cè)物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線(xiàn)性范圍內(nèi)。以13C3，15N3-CYA作為計(jì)算三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺濃度的內(nèi)標(biāo)物；以13C3，15N3-MEL作為計(jì)算三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺濃度的內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定 由于三聚氰胺及其類(lèi)似物都是沸點(diǎn)較高的極性物質(zhì)，且都含有-OH、-NH2等極性官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，直接采用氣相色譜進(jìn)行分離較為困難。為改善各組分氣相色譜性質(zhì)，在進(jìn)行儀器檢測(cè)前必須對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。經(jīng)BSTFA衍生化后，所含氨基、羥基上的氫均可被三甲基硅烷所取代，形成含有3個(gè)硅烷基結(jié)構(gòu)的衍生物（Tri-TMS），此時(shí)的色譜行為良好。衍生化后的4種化合物的質(zhì)譜圖和2種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 三聚氰胺及其類(lèi)似物和內(nèi)標(biāo)物衍生物的質(zhì)譜圖（EI源）

在采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行多組分殘留測(cè)定時(shí)，即要充分考慮監(jiān)測(cè)離子的豐度以提高靈敏度，又要考慮盡量減少樣品基質(zhì)和不同化合物之間的離子干擾。由質(zhì)譜圖可知，三聚氰胺的衍生物在m/z342，327，171，285 有特征離子，這些碎片離子的比例關(guān)系可用于三聚氰胺的定性分析。定量離子采用m/z327，此特征離子豐度最高，有助于提高檢測(cè)的靈敏度，而且受雜質(zhì)的干擾較少。三聚氰酸一酰胺的衍生物在 m/z344，329，171，100 有特征離子，而三聚氰酸一酰胺二酰胺的特征離子m/z343，328，171，285； 三聚氰酸的特征離子有 m/z345，330，100，346；雖然三聚氰酸 m/z147 離子的響應(yīng)值較高，但由于干擾非常嚴(yán)重，故未采用。三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸相應(yīng)的定量離子均采用基峰，分別為m/z344、343和345。

與被檢測(cè)化合物相比，內(nèi)標(biāo)物以定量為主，為了提高檢測(cè)的靈敏度，內(nèi)標(biāo)物可以選擇兩個(gè)監(jiān)測(cè)離子，以盡可能消除對(duì)被檢測(cè)化合物的干擾。13C3，15N3-MEL 的監(jiān)測(cè)離子為 m/z348，333，定量離子為 348。13C3，15N3-CYA的 監(jiān)測(cè) 離子 為m/z351，336，定量離子為351。由于6種化合物的選擇監(jiān)測(cè)離子較多，同時(shí)監(jiān)測(cè)這6種化合物的所有離子，勢(shì)必影響儀器對(duì)單個(gè)離子的采集速率，從而降低檢測(cè)方法的靈敏度。根據(jù)部分化合物之間色譜保留時(shí)間相差較大的特點(diǎn)，可以將監(jiān)測(cè)離子分組進(jìn)行掃描監(jiān)測(cè)，以提高檢測(cè)的靈敏度。4種三聚氰胺及其類(lèi)似物和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜條件，見(jiàn)表1。

表1 三聚氰胺及其類(lèi)似物和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜條件

2.2 氣相色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇 測(cè)定TMS衍生化后的三聚氰胺及其類(lèi)似物一般采用HP-5MS或HP-1MS等非極性或弱極性的毛細(xì)管柱。實(shí)驗(yàn)先后用（1）HP-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm 柱 ； （2）HP-1MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)按不同的色譜柱采用各自最優(yōu)化的分離條件，對(duì)色譜分離條件進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)（1）柱的分離效果更佳，各組分都得到了完全分離。因此，最后選用HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱。

2.2.2 柱溫的選擇 為了提高檢測(cè)的靈敏度，需對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行有效分離，從而實(shí)現(xiàn)分段采集。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化柱溫和程序升溫速率等參數(shù)，最后確定升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至 280℃保持5.0 min；在此條件下，可使4種物質(zhì)在一次分析中全部分離，可以實(shí)現(xiàn)分段采集，見(jiàn)圖2。

圖2 三聚氰胺類(lèi)似物標(biāo)準(zhǔn)品（1）、加樣標(biāo)樣品（2）、空白樣品（3）的衍生物總離子流圖

2.3 凈化條件的確定 目前，為了避免三聚氰胺和三聚氰酸的氨基與羥基之間發(fā)生聚合反應(yīng)，形成不溶解的水合物，生鮮乳中三聚氰胺及其類(lèi)似物測(cè)定普遍在酸性或堿性溶液條件下，由水相和乙腈等組成混合提取劑，水相主要包括三氯乙酸溶液、乙酸鉛溶液和二乙胺溶液等。乙腈具有一定的沉淀蛋白質(zhì)作用，可以除去樣品中的部分蛋白質(zhì)，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，當(dāng)乙腈相含量過(guò)高時(shí)，三聚氰酸和三聚氰胺往往容易形成網(wǎng)狀聚合物而沉淀，從而降低提取效果并最終影響的回收率和穩(wěn)定性。20%二乙胺/乙腈、2%三氯乙酸/乙腈、2.2%乙酸鉛/乙腈和乙腈水溶液等提取劑的提取效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明，在酸性或堿性條件下均有較好的回收率，而乙酸鉛沉淀蛋白時(shí)效果最佳，因此，選用20%二乙胺/乙腈為提取劑，通過(guò)對(duì)提取液比例的優(yōu)化，最終選擇20%二乙胺/乙腈比例為1∶1(V/V)，并采用1 mL飽和乙酸鉛溶液沉淀蛋白質(zhì)。

2.4 衍生化 目前，常用的TMS衍生化試劑有N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺和N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1，V/V），通過(guò)比較，兩者之間的差別不大，而B(niǎo)STFA更為常用且便宜，所以采用BSTFA為衍生化試劑。對(duì)衍生溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后，最后采用75℃恒溫衍生60 min。

2.5 方法線(xiàn)性方程和檢出限 取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，配置成三聚氰胺及其類(lèi)似物上機(jī)液濃度為20～1000 ng/mL水平進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)物的濃度為 100 ng/mL， 以13C3，15N3-CYA（m/z 351）計(jì)算 CYA（m/z 345）和 AMD（m/z 344）的濃度，以13C3，15N3-MEL（m/z 348）計(jì)算三聚氰胺（m/z 342）和三聚氰酸二酰胺（m/z 343）的濃度。以所得峰面積的比值與被檢化合物的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程，結(jié)果表明所得的相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限。采用空白基質(zhì)添加被測(cè)物的方法進(jìn)行計(jì)算，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限見(jiàn)表2。

表2 三聚氰胺及其類(lèi)似物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(n=6)

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 采用本研究建立的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)添加了 0.5、1.0、5.0、50.0 mg/kg 等不同濃度三聚氰胺及其類(lèi)似物的生鮮乳中進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度取5份平行樣品，同時(shí)進(jìn)行空白試樣，根據(jù)上述方法進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，以?xún)?nèi)標(biāo)法計(jì)算方法的回收率，并計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。方法回收率、精密度和定量限見(jiàn)表3。

表3 生鮮乳中三聚氰胺及其類(lèi)似物的添加回收率和精密度

以上結(jié)果表明，采用本方法檢測(cè)生鮮乳中的三聚氰胺及其類(lèi)似物，添加濃度為0.50～50 mg/kg時(shí)，方法的回收率為62.0%～110.0%，各樣品平行間的變異系數(shù)為2.4%～13.9%，定性能滿(mǎn)足規(guī)定的要求，說(shuō)明本方法的重復(fù)性好，同時(shí)各濃度樣品峰的分離度也很理想。

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