2663例普通女性HPV感染調查及其亞型分布

鄭華生 鄭迪楠 李劍民 林旸 蔡鑾端 鄭睦暢

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）目前已確定HPV型別大約有100多種，約40余種可感染婦女生殖道，約20余種與腫瘤相關，不同型別的生物學行為及致病能力各不相同,根據不同型號HPV與腫瘤發生的危險性高低,分為低危險型和高危險型，高危型HPV(與宮頸癌和宮頸上皮內瘤病變有關)包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68,共13種亞型;低危型HPV(與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關)包括HPV6、11、42、43、44,共5種亞型[1]。HPV感染女性生殖器引起尖銳濕疣近年來發病率不斷增高，是國家目前重點監測和防治的性傳播疾病之一。尖銳濕疣又極易復發，一個重要原因是亞臨床和潛伏感染未能及時發現和治療。大量資料顯示，女性宮頸的HPV感染相當常見，而高危險型HPV隱性感染長期存在，為宮頸癌、外陰癌重要原因。我們于2009年3月～2010年5月用前瞻性研究方法，采用PCP擴增快速導流雜交技術，對汕頭市澄海區部分事業單位2663例女職工進行HPV感染情況普查和檢測分型，現將其結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 汕頭市澄海區部分事業單位有性生活史的普通女性共2663人,年齡最大59歲，最小22歲，平均40.7歲

1.2 方法

1.2.1 做好宣傳發動工作，印發檢查須知：①檢查前24h內不應有性行為。②避開月經期，月經干凈后3d。③停止陰道沖洗和用藥3d。④注意陰道、外陰衛生。

1.2.2 主要儀器和試劑及原理

7300PCR擴增儀、Hybri Max醫用核酸分子快速雜交儀(HCⅡ)（由廣東凱普生物科技有限公司提供），HPV擴增分型檢測試劑盒。試劑用凱普HPV DNA抽提試劑盒及核酸分子快速雜交基因分型試劑盒進行病毒基因分型，采用低密度基因芯片和導流雜交技術，原理是先將病毒的DNA進行擴增，再利用核酸分子快速導流雜交技術，使目的分子導流穿過固定有DNA探針的低密度基因芯片薄膜上，而發生快速雜交。一次性快速檢測中國人群HPV95%的21種亞型，即13種高危險型（H PV16.18.31.33.35.39.45.51.52.56.58.59.68），5種低危險型（HPV6.11.42.43.44）和3種未分高低危亞型(HPV53、66、CP8304)。

1.3 標本采集

取檢醫生用窺陰器暴露宮頸，用宮頸刷在宮頸口稍用力順時針旋轉5圈，取宮頸脫落細胞標本，然后放入裝有專用細胞保存液的試管中，于4℃保存，1周內檢測。

1.4 試驗步驟

1.4.1 DNA的提取 將宮頸細胞保存液充分震蕩混勻，取800μl保存液以14000r/min離心5min，棄上清液，用DNA提取試劑盒按步說明書進行取標本DNA。

1.4.2 PCR擴增 取1μl樣品做PCR擴增,采用HPV通用引物，引物序列5’端標記生物素做標記，PCR反應體系：將23.5μl PCR-MIX、0.75μl Taq酶和1μl DNA模板混勻，設置陰、陽性對照。反應條件如下：50℃ 10min，95℃ 9min；（95℃20sec、55℃ 30sec、72℃ 30sec）共40個循環；72℃ 5min。

1.4.3 雜交和顯色 將擴增產物進行95℃ 5min，快速放入冰浴3min，取0.5μl加入500μl雜交液中，在雜交膜上反應10min，加封阻液反應5min，用酶標液洗2次，加顯色劑顯色。

1.4.4 結果判斷 肉眼觀察檢測結果，陽性為藍紫色圓點，根據雜交膜探針分布的位置，判斷陽性點為何種HPV亞型，多個圓點即為多重感染，每次雜交試驗均設陰性、陽性對照。

1.5 統計學處理 采用x2檢驗,計量資料采用t驗檢，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV陽性結果

用HybriMax導流技術檢測2663例女性宮頸標本HPV DNA,共檢出214例陽性，總感染率為8.04%，亞型陽性244例，其中高危中高危險型別HPV198例，占亞型總數的81.15%，低危險型別18例。占亞型總數的7.38%，未分高低危亞型(HPV53、66、CP8304)28例，占亞型總數的11.48%。在214例陽性結果中，單一亞型感染者187例，占87.38%，混合亞型27例、占12.62%，最多是3種亞型混合感染有3例。結果見表1。

表1 244例HPV陽性高低危亞型的構成比

2.2 HPV陽性的亞型分布

214例女性檢出244例HPV亞型中，陽性比率最高3個是HPV52（27.8%）、HPV16（18.85%）、HPV58(12.3%)，依次是HPV33(7.38)、CP8304(6.97%)、HPV18(4.10%)，其中HPV43、HPV51、HPV56未檢出，詳見表2。

表2 244例HPV陽性的亞型分布情況

2.3 HPV感染者的年齡分布

被檢查的2663例女性中，年齡最大60歲，最小22歲，平均40.7歲,總共檢出HPV陽性214例在各個年齡段分布有所不同，檢出率最高為31～40歲（11.62%），檢出率最低為21～30歲（4.65%），但各組年齡段的檢出率經統計學處理差異無顯著性（P＞0.05），具體分布情況見表3。

表3 2663 例婦女的年齡分布和HPV陽性率的情況

3 討論

人類乳頭瘤病毒（HPV）是無包膜、20面體對稱病毒，基因組為閉合環狀DNA，長度在7200～8000bp之間，它具有鱗狀上皮細胞的親嗜性，生活周期包含早期和晚期2個階段，分化過程中的鱗狀上皮細胞提供了HPV復制、病毒衣殼蛋白合成和病毒粒子包裝所必需的內環境[2]。HPV感染可能的致病機制是在機體免疫力低下時整合到機體的核染色體基因組上，導致p53基因失活、不能正常表達，進而引起細胞增殖調節失控[3]。隨著HPV研究的深入，單基因功能闡釋已經比較透徹，為治療HPV感染提供了理論基礎。我們用HybrMax法來檢測HPV,是導流雜交技術和低密度基因芯片技術的結合，利用PCR擴增提高檢測的靈敏度，分子雜交的特異性高。運用它的高通量的特點可以一次性檢測HPV的21種亞型，大大地提高分型和檢測率，凱普公司的這種方法有良好的質控體系，包括陰性對照、內對照和biotin對點，對基因擴增和雜交全程控制，整個過程僅3.5h，結果準確快捷。

3.1 有關HPV感染率

由于檢測的對象、采用的檢測技術以及研究的地區、人群的不同，各國各地區報道的HPV感染率高低不一，本組檢測結果HPV感染率為8.03%，與對深圳某銀行系統的1276名女性員工進行HPV檢查的陽性率為7.37%[4]相接近，比吳春龍等報導的臺州地區女性HPV感染陽性率20.8%[5]、張詠梅等報導的湘潭地區陽性率21.79%[6]低。感染率的高低，除了地區差異，可能主要是檢查對象不同，后2組對象都是婦科門診病人，而我們檢查對象是事業單位女職工。但這可以看出，女性感染HPV是很常見，如果被檢人群是懷疑宮頸癌或生殖器疣患者，感染率會很高，國際宮頸癌生物學研究（IBSCC）機構對HPV感染與宮頸癌的相關性進行大樣本統計后報道，93%以上的宮頸癌組織中可檢出HPV，表明了HPV感染是導致宮頸癌的重要原因[4]。因此應加強女性HPV感染的檢查和監測，對生殖器疣、宮頸癌的防治有重要臨床意義。

3.2 HPV感染與年齡的關系

本組檢測結果中，感染率最高組年齡段為31～40歲（11.62%），依次是51～60歲（8.97%）、41～50歲（5.91%）、21～30歲感染率較低為4.65%，但各組年齡段的檢出率差異無顯著性（P＞0.05），感染率最高的年齡組和各組年齡段的檢出率差異無顯著性與深圳白領女性調查[4]和湘潭地區[6]相似，與臺州地區[5]的隨年齡增大而感染率增高以及各組年齡段的檢出率差異有顯著性不同。

3.3 HPV感染的亞型分布與防治策略

HPV感染存在多樣性和地區性差異，各國各地區型別有所不同，國際癌癥研究協會（IARC）的研究顯示，最常見的亞型為HPV16、18，而HPV45在非洲相對較多，HPV33則主要集中在歐洲，亞洲國家則以HPV52、58常見。本組檢測結果中，高危險型HPV占81.15%，低危險型占7.38%，中國人常見亞型(HPV53、66、CP8304)占11.48%；亞型中以HPV52為第一位，依次是HPV16、HPV58，與江雨等[7]報導的閩南地區前3位分別是HPV52、58、16和湘潭地區[3]前3位HPV16、52、58相類似，但稍有差異。

了解本地區的亞型情況對今后防治有重要指導作用，目前疫苗預防HPV感染的宮頸癌效果顯著，2006年美國默克公司研制的名為“加德而”的疫苗，對預防引起約70%宮頸癌的HPV16.18型及引起約90%生殖器疣的HPV6.11型感染很有效。目前上市的疫苗均為二價疫苗（16/18）或四價疫苗（16/18/6/11），沒有涵蓋排在本地區感染率高居第1、3位的HPV-52、58這2個亞型，因此，針對我國和本地區不同亞型的疫苗研究，將是預防HPV感染和致病的一個重要方向。由此可見，了解本地區的流行病情況，能提供制訂科學的干預措施，盡快阻斷HPV感染的傳播，降低HPV感染的發生率、發病率，重點是對高危HPV感染的人群干預，積極監測、隨訪，定期復查和合理的治療。目前，我們用這種凱普PCP擴增快速導流雜交技術來檢測女性HPV感染和分型的方法，快捷準確，對本地區女性生殖道腫瘤（特別是宮頸癌）和生殖器疣的防治具有重要臨床意義。

[1]Matsumoto K.Human papillomavirus and cervical cancer[J].Nippon Rinsho,2007,65(11)：2113-2124.

[2]梁德光,何之恒,藍柯.人乳頭瘤病毒及其致瘤機制的研究進展[J].生命科學,2008(6)：845-847.

[3]Steller MA.Human paplliomavirus,it's genes and cancer vaccines[J].Cancer Cell,2003,3：7-8.

[4]郭廣洲、姜萍、張冰凌,等，深圳白領女性HPV感染調查及其亞型分布[J].中國熱帶醫學，2007，7(10)：1775-1776.

[5]吳春龍，郭鋒，齊娟飛.10007例臺州女性HPV感染狀況及21中基因亞型分析[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20（12）：3461-3463.

[6]張詠梅,周晶,龔志紅.湘潭地區HPV感染及不同亞型分布[J].中國現代醫生,2010,48(34)：108-109.

[7]江雨，李清，李健,等.閩南女性人乳頭瘤病毒感染流行病學調查分析[J].現在預防醫學,2010,37（1）：110-111.