氧化樂果中毒致肺損傷大鼠血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α表達相關性的實驗研究

李孟秦 蔣智 曹小平

在發展中國家，急性有機磷殺蟲藥中毒（acute organ phosphorous pesticide poisoning，AOPP）是急診科常見的急危重癥之一[1]。重癥患者常因肺水腫、腦水腫、呼吸循環衰竭死亡。據統計，我國1995年AOPP患者的病死率高達12.8%。AOPP患者常并發肺損傷，肺水腫是重度AOPP患者最常見的并發癥[2]。AOPP所致肺水腫早期主要表現為肺間質水腫，若繼續發展可進展為肺泡性肺水腫，終末期患者可因中樞性呼吸抑制、呼吸循環衰竭或多臟器衰竭而死亡，呼吸肌麻痹和肺水腫也可能為致死的主要原因[3]。TNF-α是最重要的炎癥因子之一，血清TNF-α濃度及測量方法簡便，本實驗研究目的為證實血清TNF-α濃度是否能間接反映肺組織TNF-α水平及肺損傷程度。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型

選擇健康雄性SD大鼠（6周齡）150只，體重200～250g，隨機分成三組，A組為對照組，B組為染毒組。A組大鼠30只，B組60只。A組灌胃注射無菌生理鹽水，將B組以0.4%氧化樂果乳油工作液以45mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型。以出現流涎、肌顫、呼吸困難、步態不穩為標準選擇AOPP模型，剔除中毒癥狀不明顯以及死亡的個體。將實驗過程分為染毒后或生理鹽水30min、3h、6h、12h、24h、48h 6個觀察時點。

1.2 留取標本

在對應時間點分別于各組中隨機抽取5只大鼠，用頸椎脫臼法處死后摘取眼球放血，4℃靜置3h自然凝固，然后高速冷凍離心機5000rmp離心5min小心取上層血清放至-80℃冰箱內備用；打開胸腔取出肺臟，用生理鹽水沖去表面血跡并用濾紙擦干并稱重，將雙肺分別用10%甲醛固定后脫水、包埋、切片。

1.3 肺系數測定

用公式肺濕重/體重×100%測定肺系數。將雙肺分別用10%甲醛固定后脫水、包埋、切片，左肺組織HE染色觀察肺泡及肺間質形態變化，右肺切片以免疫組化染色后在200倍光鏡下拍照，用圖像處理軟件IPP6.0處理圖片計算光密度值，光密度值與TNF-α水平成正相關。用光密度值代表肺組織TNF-α水平。用ELISA法測定血清TNF-α濃度。

1.4 統計方法

所有計量資料均采用SPSS11.5統計軟件分析，用相關回歸分析A、B兩組大鼠的血清TNF-α濃度、肺TNF-α水平與肺系數相關性，血清TNF-α濃度與肺TNF-α水平相關性。

2 結果

2.1 實驗過程中大鼠的反應及死亡數量

A組大鼠在實驗過程中無異常反應，除處死對象外無死亡個體。B組大鼠在氧化樂果灌胃后10min均出現有機磷殺蟲劑中毒癥狀：流涎、肌肉震顫、步態不穩、呼吸急促、腹瀉，癥狀于6h達高峰，12h后逐漸減輕，24h后癥狀消失。除處死個體外，B組大鼠死亡數為29只。

2.2 肺組織病理學改變

A組大鼠各時間點肺組織切片均正常。B組大鼠肺組織于染毒后30min～6h出現逐漸加重的肺間質充血、肺泡間隔增寬，局部可見肺泡內紅細胞聚集。12～48h上述變化逐漸減輕，但仍未恢復至正常。

2.3 血清與肺組織TNF-α表達以及肺系數的變化

對大鼠肺組織切片免疫組化結果進行分析，TNF-α表達的部位即圖片中棕黃色物質的部分，主要位于肺間質細胞質中，部分細胞核也有表達。肺組織TNF-α水平越高，照片中棕黃色部分著色越深。用圖像處理軟件IPP6.0處理圖片計算光密度值，光密度值與TNF-α水平呈正相關。因此，用光密度值代表肺組織TNF-α水平。血清TNF-α濃度及肺系數變化見表1。

表1 大鼠血清TNF-α濃度、肺組織TNF-α水平及肺系數

2.4 TNF-α表達與肺系數相關性

血清TNF-α濃度與肺系數，肺組織TNF-α水平與肺系數，血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平均呈正相關（相關系數r分別為0.93，0.91，0.96）。

3 討論

AOPP在農藥中毒中發病率最高，重癥患者合并多器官功能衰竭的發病率、死亡率高，肺往往是最先受累的器官。有機磷殺蟲劑進入機體作為一種強烈的應激原使機體產生一系列應激反應，刺激免疫系統釋放大量細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6，一旦水平異常增高則會損傷機體正常組織。TNF-α是早期主要的前炎癥因子之一，在內毒素血癥試驗中，提前中和TNF-α的活性可阻斷其他細胞因子釋放[4]。

本實驗以氧化樂果灌胃染毒制造AOPP致肺損傷模型，灌胃后染毒大鼠出現毒蕈堿樣癥狀及煙堿樣癥狀。染毒大鼠肺系數增大、肺組織HE染色發現肺泡間隔增寬、肺泡內紅細胞聚集及血清TNF-α濃度的增高，模型復制成功。本實驗結果發現血清TNF-α濃度、肺組織TNF-α水平與肺系數呈正相關，血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平呈正相關，說明血清TNF-α濃度可間接反映肺組織TNF-α水平以及肺損傷嚴重程度。

臨床中有大量有機磷中毒并發肺損傷患者，由于難以獲取標本，通過肺組織檢查如病理學檢驗、免疫組化確定患者肺損傷的程度不現實。血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平及肺損傷程度有良好的相關性，并且患者的血液標本容易采集，因此可用血清TNF-α濃度來間接反映肺組織TNF-α水平及肺損傷的程度，從而為臨床上以血清TNF-α濃度評估有機磷中毒致肺損傷嚴重程度提供理論依據。

[1]王巧珍.69例急性有機磷農藥中毒的急救與護理體會[J].當代醫學，2010，16（21）：120-121.

[2]葉傳勇，陳佳山，蔣煒，等.597例急性有機磷農藥中毒并發癥的臨床分析及搶救體會[J].中國危重病急救醫學，2001，13（6）：373-374.

[3]于潤江.中國內科專家經驗文集[M].沈陽：沈陽出版社，1993：923-933.

[4]Suffredini AF，Reda D，Bands SM，et al.Effects of recombinant diametric TNF receptor on inflammatory responses following intravenous antitoxin administration[J].J Immunol，1995，155（10）：5038-5045.