谷氨酰胺對腸粘膜上皮細胞合成多聚免疫球蛋白受體的影響

中國醫科大學附屬第一醫院傳染科 (沈陽 110001)崔 巍 孫翠明 劉 沛

sIgA是腸粘膜表面最重要的免疫防御因子,由漿細胞產生的 Ig A和腸上皮細胞產生的分泌片(Secretory component,SC)組裝而成,能夠抑制細菌粘附,在腸道局部免疫中發揮重要作用。有研究表明腸粘膜局部 sIg A減少是暴發性肝衰竭、燒傷、膿毒血癥等多種疾病中促進細菌移位,誘發全身性炎癥反應綜合征的重要因素[1,2]。谷氨酰胺是目前為止最有效的腸粘膜保護劑,能夠促進腸上皮細胞更新,維持腸上皮細胞的完整性。近年研究發現谷氨酰胺缺乏可以引起細菌移位[3],但是具體的作用機制還不十分清楚,是否與抑制 sIgA的產生有關目前還沒有報道。因此本文觀察了谷氨酰胺缺乏對腸上皮細胞合成分泌片的影響,以探討谷氨酰胺在腸粘膜局部免疫功能中的作用。

材料與方法

1 材料選擇

1.1 細胞株:Caco-2細胞株購自 American Type Culture Collection。

1.2 主要試劑:DM EM高糖培養基、FBS購自美國 GIBCO-BRL公司;非必須氨基酸購自美國 Hyclone公司;L-GLN、小鼠抗 SC多克隆抗體購自美國 Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司;RNA PCR試劑盒、T7體外轉錄試劑盒、Real time quantitive PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養:Caco-2細胞應用含有 200 ml/L胎牛血清、10 g/L非必須氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液和不同濃度的谷氨酰胺(0、0.1、1、4mM)的 DM EM培養液,在 37°C、50 ml/L CO2條件下進行培養,每 7 d按 1∶2的比例傳代,傳代后 7 d左右細胞生長達到融合,提取細胞蛋白或總 RNA進行后續實驗。

2.2 Western blot:應用 RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白;應用 BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,具體方法按照說明書進行。將樣品調成相同蛋白濃度,沸水煮 5min進行蛋白變性;每個樣本取等量蛋白(約 50 μ g)進行 8%SDS-PAGE凝膠電泳 ,電壓 100V,90min;電泳后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上,電壓 50V,2h;脫脂奶粉封閉 2h,加入小鼠抗 SC抗體 (1∶1000)4℃過夜;然后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠-IgG抗體(1∶3000)室溫 2h,ECL顯色。以β-actin作為內參,結果通過天能圖像分析系統進行分析,SC蛋白含量=樣本 SC蛋白灰度值 /同一樣本β-actin灰度值。

2.3 實時定量 PCR(Real time quantitative PCR):用 T RIZOL一步法提取細胞總 RNA。采用SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測 SC mRNA。簡言之先構建目的基因(SC基因)和管家基因(GAPDH)的RNA標準品,制作標準曲線,利用標準曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進行定量。通過管家基因的校正,檢測各組細胞樣本中 SC目的基因的相對表達量。SC mRNA的相對表達量 = SC基因拷貝數 /GAPDH基因拷貝數。 PCR反應體系的組成參照說明書進行,反應條件為逆轉錄反應 42℃10min,95℃2min,PCR擴增 95℃ 10 s1個循環 ,95℃5 s,60℃20s 45個循環。

SC和 GAPDH引物序列如下表,SC產物片段89bp,GAPDH產物片段 144bp。

SC-F 5'-TGTTGCCACCACTGAGAGCAC-3'SC-R 5'-CTT TGTAGGCCATCTCGGCTTC-3'GAPDH-F 5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'GAPDH-R 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'

3 統計學分析 所有數據以 Mean±SD表示,應用 SPSS13.0,采用單因素方差分析(AVONA)的 LSD方法對各組間數據進行比較,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 谷氨酰胺對腸上皮細胞 SC蛋白合成的影響(圖 1):在 80 kDa處可見特異性蛋白條帶,對各條帶進行灰度分析發現:谷氨酰胺缺乏時,SC蛋白的相對含量為(0.28±0.02),逐漸增加培養液谷氨酰胺濃度后各組 SC蛋白的相對含量逐漸增加(0.33±0.03,0.88±0.02,1.02±0.03),差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能夠影響 Caco-2細胞 SC蛋白的合成。

圖1 各組 SC蛋白 Western blot結果:可見隨著 GLN濃度的逐漸增加,SC蛋白的相對含量增加(*與 GLN 0mM組相比P＜0.05)

2 谷氨酰胺對腸上皮細胞 SC m RNA表達的影響 (圖 2):電泳結果和 OD值結果顯示,構建的人 SC基因和 GAPDH基因 RNA標準品片段長度分別為342bp和 1043bp。其質量良好,所獲得的標準曲線相關系數為 0.998,線性關系良好,融解曲線顯示特異性良好。利用標準曲線對樣品中的 SC基因和 GAPDH基因進行定量,結果發現隨著谷氨酰胺濃度的增加,SC mRNA的表達量逐漸上調(1.0±0.01,1.13±0.06,1.39±0.04,1.48± 0.07),各組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能夠影響 Caco-2細胞 SC mRNA的表達。

圖2 各組 SC mRNA檢測結果:左圖為 SC擴增曲線,下圖為定量分析結果,可見隨著 GLN濃度的增加,SC mRN A的表達量逐漸上調(*與 GLN 0mM組相比 P＜0.05)

討 論

1988年 Wilmore等提出“腸道是應激的中心器官”學說,認為應激時腸管呈短暫或長時間的腸屏障功能損害,腸粘膜萎縮、通透性增加,細菌和毒素穿越腸粘膜屏障移行到腸系膜淋巴結或其他遠處臟器形成細菌易位,促進了全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的發生 ,通過一系列級聯反應可最終導致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[4]。

細菌和毒素穿越腸粘膜屏障必須首先粘附在腸上皮細胞上,這一過程與腸道局部免疫功能狀態特別是sIg A密切相關。sIg A對腸道菌群尤其是 G-桿菌具有特殊的親和力,能夠包被細菌,封閉細菌與腸上皮細胞結合的特異部位,阻止其與腸上皮細胞粘附,避免細菌通過腸上皮細胞發生移位;sIgA還可中和腸道內的毒素、酶和病毒,并結合抗原分子形成免疫復合物,介導吞噬細胞清除病原微生物[5],因此 sIg A是維持正常腸粘膜屏障功能的重要環節。

GLN是目前最有效的腸粘膜保護劑,是生物大分子如嘌呤、嘧啶、核酸及蛋白質的重要氮和碳的前體,也是合成 ATP的前提,具有促進蛋白質合成和抑制蛋白質降解的作用,在維持腸道粘膜代謝、結構和功能方面發揮重要作用[6]。既往研究認為 GLN主要是通過加快腸上皮細胞更新速度,減少上皮細胞凋亡,從而維持完整的腸粘膜機械屏障來發揮作用[7,8]。近年來研究表明 GLN對腸粘膜免疫屏障亦有影響,表現為 GLN缺乏時腸道細菌包被率下降,細菌移位增加,補充GLN可以增加燒傷動物腸道局部 sIg A的含量[9],這些研究提示腸道免疫屏障也是 GLN影響腸粘膜屏障功能的一個重要靶點,因此我們應用體外細胞培養觀察了 GLN對腸上皮細胞合成 sIgA的重要組成部分—SC的影響。

結果表明在 GLN缺乏情況下,腸上皮細胞只能合成較低含量的 SC,增加 GLN濃度到 1mM以上,SC蛋白含量明顯增加。 SC是分泌性免疫系統的重要因子,參與 sIg A的形成和選擇性上皮運輸。SC由腸上皮細胞產生,與腸粘膜內 Ig A漿細胞分泌的聚合 Ig A結合后由腸上皮細胞以內化的方式攜入胞內形成吞飲小泡,再轉運至細胞頂端,以胞吐的方式釋放入粘膜腔。結合的 SC能夠降低 sIgA對腸腔內蛋白酶的敏感性;未結合的 SC稱為游離 SC,De Araujo等研究發現,游離 SC是抵抗大腸桿菌的重要非特異性防御因素[10]。本研究結果提示 GLN缺乏時 SC合成減少,導致 sIg A的合成和轉運障礙,由 SC介導的非特異性防御因素和分泌性免疫功能受到抑制,腸粘膜免疫屏障缺陷,最終引起細菌移位;補充 GLN能夠糾正這一損傷,抑制細菌移位。

機體調節某種蛋白的合成,不外乎在轉錄水平或蛋白水平進行,為了明確 GLN影響 SC蛋白合成的作用環節,我們應用實時定量 PCR技術進一步檢測了不同濃度 GLN對 SC mRNA合成的影響。結果表明:增加 GLN濃度可以上調 SC mRNA的表達,說明 GLN影響 SC蛋白的合成發生在轉錄水平,這為進一步研究 GLN影響 SC蛋白合成的信號通路提供基礎。

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