低壓低氧對大鼠 CD34與 V EGF表達的影響

西安交通大學醫學院 (西安 710061)賀 學 盛業萌 劉恩岐

在高原中,大氣壓中氧分壓降低,引起缺氧環境,從而引發高原不適癥狀。長期生活在高原環境中的生物,發生生理性適應和生物適應,針對低氧環境,機體建立了一系列代謝補償機制,以更好的適應高原環境。細胞的正常代謝和生存需要氧的參與,在高原低氧環境下,機體通過增加氧的傳遞,加快血液循環或激活不需要氧的代謝旁路,來維持機體保持正常的生理狀態[1,2]。研究發現,在高原地區,低氧環境改變了當地居民的心血管系統功能,使他們的心血管系統發生了適應性的改變。心肌正常代謝所需要的氧氣和物質主要通過心肌毛細血管的運輸來完成,因此,心肌毛細血管的數量嚴重影響心臟的代謝過程。研究證實血管內成因子 (Vascular endothelial grow thfactor,VEGF)和CD34在血管的生成中發揮著重要作用。本實驗通過檢測在低氧環境中大鼠心臟 VEGF和 CD34的表達變化,為揭示低氧對心肌血管生成的作用提供依據。

材料與方法

1 動物及分組 雄性健康的 Sprague-Dawley大鼠 60只,體重約為 220g,由交大醫學院實驗動物中心提供。隨機分為四組,分別為正常組,低氧 2周組,低氧4周組,低氧 6周組。除正常組外 ,其余各組大鼠置于模擬海拔 4000m的低壓氧艙內飼養,正常組與低氧組飼養的溫度,濕度,光照相同。

2 主要儀器和試劑 低壓氧艙(第四軍醫大學),核酸蛋白定量儀 (Eppendorf公司),PCR擴增儀(Takara公司 ),電泳儀、轉膜等 (Bio-Rad公司),凝膠成像系統(UVP公司);引物合成(北京奧科),RNA提取、RT-PCR試劑盒(Takara公司),蛋白提取試劑盒(roche公司 ),CD34、VEGF抗體 (Santa公司 )。

3 病理學觀察 取每組大鼠 5只,斷頭處死,剖腹取右心室,剪去心房組織,置于 4℃生理鹽水中沖洗血液,然后放置在 10%的福爾馬林溶液中固定 24小時以上,最后進行脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察拍照。

4 CD34、V EGF mRN A表達的檢測 將保存于液氮中的心肌樣本置于研缽中,加入液氮進行研磨,按照 RNAi plus的試劑盒說明書進行總 RNA的提取。利用核酸蛋白定量儀檢測提取的 RNA純度,測定RNA濃度。依照反轉錄試劑盒說明書,取 RNA溶液1 μ l,在反轉錄酶作用下合成 cDNA。 然后以 cDNA為模板,對目的基因進行實時定量 PCR,檢測目的基因的表達量的變化。引物序列 β-actin上游:5′-CGT TGACATCCGT AAAGACCTC-3′, 下 游:5′-T AGGAGCCAGGGCAGT AATCT-3′;CD 34上 游:5′-CCTGCCGTCTGTCAATGT T TC-3′, 下 游:5′-GCACTCCTCGGATTCCT GAAC-3′;VEGF 上 游:5′-TGTGAGCCTT GTTCAGAGCG-3′, 下 游: 5′-GACGGTGACGATGGTGGTGT-3′。 PCR條 件 為:95℃預變性 10s,95℃ 5s,60℃ 30s,40個循環。以目的基因與內參的熒光強度比值作為目的基因的相對表達量。

5 免疫印跡 (Western blot)檢測 CD34、V EGF的表達 取液氮保存的心肌樣本,在冰上解凍后,用剪刀剪碎,繼而加入含蛋白酶抑制劑細胞裂解液,在低溫下進行研磨,待研磨充分后,在冰上放置 20min,充分裂解后,在低溫冷凍離心機上高速離心,12000rpm,20min,取上清,保留檢測部分,其余-80℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,然后進行 SDSPAGE電泳,電壓 120V,時間 2h。 Bio-Rad濕轉轉膜槽,200mA恒流轉印 90min至 PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h,加一抗 4℃孵育過夜,加辣根過氧化酶標記二抗,室溫孵育 2 h,在凝膠成像系統上顯色,圖像采集。

結 果

1 病理學觀察:結果(圖 1)顯示,與正常對照組相比,低氧組大鼠心肌細變得肥大,細胞出現纖維化現象,隨著低氧時間的延長,這種現象愈發明顯。

2 低氧對大鼠右心室 CD34、VEGF mRNA表達的影響 (圖 2):對照組、低氧 2、4、6周組心臟右心室CD34mRNA相對表達量分別為 8.3× 10-5、9.0×10-5、 9.6× 10-5、2.1× 10-4(圖 2上 ),V EGF的表達量 分別為 8.1× 10-4、 1.8× 10-3、3.0× 10-3、5.5×10-3(圖 2下)?？梢姷脱?6周組 CD34和VEGF的表達量顯著的高于正常組,其中 VEGF的升高最為明顯。

圖1 病理學結果(A、B、C、D分別為正常、低氧 2、4、6周組)

圖2 CD34、V EGF mRN A在心肌組織中的相對表達量

圖3 CD34、V EGF蛋白在心肌組織中的相對表達量

3 低氧對大鼠右心室 CD34、VEGF蛋白表達水平的影響(圖 3):圖中從左到右對照組、低氧 2、4、6周組心臟右心室 CD34的蛋白相對表達量分別為:0.14、0.22、 0.31、0.48;VEGF的相對表達量分別為:0.18、0.27、0.39、0.56。 從數據能夠得出在低氧組,CD34和VEGF的表達量都明顯高于正常對照組。

討 論

氧是維持生存的必要因素,機體進行各種新陳代謝都是在氧的參與下進行的。低大氣壓,低氧分壓,缺氧程度大等是高原環境的特點,嚴重影響動植物的生存與發展,許多疾病的發生都是由于缺氧引起的。長期生活在高原低氧環境下的生物,其某些組織結構和生理機能發生了適應性的變化,以更好的適應高原低氧環境。動物對低氧環境的適應機制研究已取得一定進展,他們發現高原動物的紅細胞數和血紅蛋白含量明顯比生活在平原地區的高;許多高原生物肺泡數目多,體積小,單位面積肺血管數目增多,從而有助于吸取更多的氧氣,同時減緩肺動脈壓力的升高[3];有些高原生物的血紅蛋白發生突變,與氧氣的結合能力更高,從而適應高原低氧環境;生物體還通過調節 NO的產生量,利用低氧誘導因子的調節等來適應低氧環境[4]。

CD34選擇性地表達于造血干 /祖細胞膜上,是一種高度糖基化的跨膜蛋白,同時該因子也在血管內皮細胞及其它組織中表達。CD34在造血祖細胞表達最高,但是隨著細胞分化、成熟,CD34抗體的表達逐漸減少,甚至消失[5,6]。可見 CD34與血管的生成密切相關,在新生血管中的表達十分明顯。Fujimoto等研究表明,對造血干 /祖細胞進行體外培養,CD34+細胞在總細胞中所占的比例呈下降趨勢[7]。宋克東等人研究發現在低氧環境培養中,CD34+細胞在總細胞中所占比例呈上升趨勢,擴增倍數明顯提高[8]。本實驗發現,在低氧環境中,CD34在心肌中的表達明顯提高,可能作為一種保護機制,促進新生血管的產生,滿足心肌細胞對氧氣等的需求。

作為一種細胞因子,VEGF是一種分子量為 46 KD的二聚體多肽,廣泛存在于動物組織中。V EGF以內皮細胞為特異性靶細胞,能夠促進血管內皮細胞的有絲分裂,增加血管通透性、降低血管張力等多種功能[9]。有研究表明,相對與正常環境,低氧能夠誘導VEGF基因的表達,促進毛細血管的生成,增強血液為組織提供氧氣的效率,從而提高動物對低氧環境的適應能力[10,11]。王雪蓮等人的研究表明在高原低氧環境下,在低氧誘導因子作用下,VEGF的表達明顯提高,通過促進新生血管的生成來適應高原環境[12]。本實驗研究結果與他們的一致。由于低氧環境的作用,在大鼠心肌組織中,VEGF的表達在 mRNA水平和蛋白水平都顯著增高,

綜上所述,通過研究在低氧環境下 SD大鼠心肌組織中 CD34和 VEGF的表達變化,闡述了 CD34和VEGF對大鼠適應低氧條件所起的作用,為進一步揭示生物對高原低氧環境的適應機制提供參考,為探索高原缺氧的高原醫學提供一定的理論依據,推動高原醫學的發展。

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