復黃生肌愈創油膏對糖尿病難愈性創面 TGF-β1、I、Ⅲ型膠原的影響*

肖秀麗 王振宜 唐漢鈞 上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院中醫外科(上海 201900)

創面愈合是皮膚外科領域中一個重要問題,而糖尿病、截癱、局部射線照射等所致的創面臨床愈合困難,因此探究創面修復與再生的機理,尋找有效地促進創面愈合的治療方法,有著十分重要的意義。復黃生肌愈創(FuhuangShengji Yuchuang,FH-SJYC)油膏,簡稱復黃膏 ,是唐漢鈞教授根據長期治療皮膚創面的經驗 ,根據其“瘀祛新生”理論所創制,對各種難愈性創面具有較好的效果[1]。為進一步探討祛瘀生肌法促進創面愈合機制,本研究擬通過大鼠糖尿病創面模型外用復黃膏后創面中生長因子變化的動態研究,探討其部分作用機理。

1 材料與方法 1.1 實驗動物及分組 清潔級 Wistar大鼠,雄性,體質量(220±20)g,共 54只。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,動物許可證號為醫動字第 SCXK(滬)2003-0003號。用隨機數字表法先按大鼠造模后換藥 3d和 11 d兩個觀測時段將其隨機分為 2組,每組 27只;再將每一時段的實驗動物按隨機數字表法分為創面對照組、模型組和復黃膏組,每組 9只。

1.2 藥物組成及制備 復黃生肌愈創油膏(復黃膏),由紫草、血竭、大黃、龍骨、雞蛋黃、珍珠層粉、豬皮、麻油等組成。由上海中醫藥大學龍華醫院制劑室制備成油膏(藥劑批號為040720)。正常對照組和糖尿病對照組:生理鹽水(龍華醫院提供)。

1.3 試劑和儀器 四氧嘧啶(Alloxan),試劑編號:2244-11-3,瑞士 FULKA公司產品(由上海中醫藥大學藥理毒性實驗室提供)。羅氏 ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀和血糖測試試紙,編號:2005-10,22896931,瑞士 Roche公司產品。0.1%鹽酸氯胺酮,試劑編號:KD061201,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品。RT試劑盒 DR019A,廣州中山大學達安基因股份有限公司產品。M ARK D501A,上海寶生物工程技術公司產品。RN A反轉錄試劑盒,T AKARA公司產品。實時熒光定量 PCR試劑盒,美國 ABI公司產品。全自動實時熒光定量 PCR儀(美國 ABI 7300),美國 ABI公司產品。

1.4 實驗方法 1.4.1 動物創面造模:糖尿病大鼠模型制造參照傅小兵等[2]方法改進,隨機分為正常對照組 ,糖尿病對照組和糖尿病實驗 (復黃膏)組,禁食 24 h后 (飲水不限),分別在乙醚麻醉下尾靜脈 1次注射 1.5%四氧嘧啶(50 mg/kg,實驗組)及等體積生理鹽水(對照組 ),造模后 4 h后給予 5%葡萄糖水溶液飲用,次日經尾部取血測血糖,血糖值大于 10mmol/L上 ,則表明造模成功。模型制成后,每 3天測血糖 1次,直到動物處死。創面造模:糖尿病大鼠模型制造完成后 3d,參照傅小兵等[3]方法改進,Wister大鼠用 1%鹽酸氯胺酮(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。局部備皮,常規消毒后,于 Wister大鼠背部取直徑為 3 cm左右圓形切口,剪開皮膚全層,至皮下筋膜,無菌敷料加蓋 ,每日換藥 1次。創面對照組造模方法同上。造糖尿病模型時大鼠共死亡 8只,在創面模型造模時死亡 5只,治療、飼養過程中又有 3只大鼠死亡。最后可供實驗觀察的大鼠共 38只,其中 3和 11 d兩個時間段各 19只 ,每個時間段又分為 3組,其中創面對照組 7只,模型組和復黃膏組均為 6只。

1.4.2 用藥:3組大鼠于造模當日開始換藥,換藥前用 1:5 000呋喃西林清潔創面。創面對照組和模型組外敷單層生理鹽水紗布,復黃膏組外敷單層復黃膏紗布。3組大鼠傷口均外用兩層消毒干紗布覆蓋固定 ,每日換藥 1次。

1.4.3 動物創面面積測量及標本采集:用藥后第 3天和第 11天,分別將動物麻醉處死。測量創傷面積,并計算創面閉合指數。計算公式:創面閉合指數=(1-治療后創面面積/原始創面面積)×100%。用眼科手術剪分離新生創面肉芽組織,并成塊取下,為所需實驗樣品。

1.4.4 Real-time RT-PCR實驗步驟:1.4.4.1 引物、探針的設計與合成:根據 GenBank提供的 CRD-BP mRNA序列(LOCU S ID:AF198254),利用 Primer Premier5.0設計內、外引物及探針,引物均跨內含子序列,保證擴增的特異性。(引物、探針由中山大學達安基因診斷中心合成。)引物和探針序列Custom_NameSequence ProModify:FRT GF-β15'-CGCCT

GAGTGGCTGTCTT TTG-3'5'端 FAM修飾;3'端 Tamra修飾5'-GCTGCTGACCCCCACTGAT-3'5'-TGCCGGACAACT CCAGTGA-3'CollagenⅠ5'-AAGGCTGCAACCTGGATGCC ATCA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-GGAGAGTA CTGGATCGACCCTAAC-35'-CTGACCTGTCTCCATGT T GCA-3'CollagenⅢ5'-ATGTCTGGAAGCCAGAACCATGT CA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-CTACCTTGGT CAGTCCTATGAGTCTAGA-35'-TCCCGAGTCGCAGAC ACAT AT-3'GAPDH5'-CATCCTGGGCTACACTGAGGAC CA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-CCGAGGGCCCA CTAAAGG-3'5'-GCTGT TGAAGTCACAGGAGACAA-3'

1.4.4.2 組織 RN A提取:將所試驗的標本按序排放在管架,依次將各組組織轉移至 5 mL玻璃試管中,依次每一管中加入 1 mL TRIzol(預冷 ),電動勻漿器 (轉速 8000r/min)處理 30～ 45s。每標本間處理后用酒精(75%乙醇的配置∶ 1倍的DEPC處理水加 3倍的無水乙醇)棉球擦拭,DEPC處理水清洗。依次將勻漿液轉至 1.5mL Eppendorf管中,各管中加入氯仿 200μL,激烈振蕩 15s,4℃、12 000 r/min離心 15 min。小心吸出水層加入依次編號的 Eppendorf管中,再加入二倍體積的異丙醇(約 600μL),混勻,置于-20℃冰箱中,30min。 4℃、10 000r/min離心 15min,棄上清留沉淀。用 650μL75%乙醇洗滌沉淀,4℃,8 000 r/min,離心 5min,棄上清留沉淀 ,并重復此步驟 1次,充分吸盡殘留液。打開管蓋,干式恒溫器 65℃,5～10min,烘干。 20μL DEPC處理水溶解 RNA,進行電泳并進行紫外分析測定,合格者-20℃冰箱保存待用。

1.4.4.3 RNA濃度測定:測同一樣品在 260nm和 280nm光吸收值,若 OD260nm/OD280nm接近 2.0,則說明樣品純度高。

1.4.4.4 RN A變性凝膠電泳:用 DEPC處理的適量蒸餾水,加熱融化瓊脂糖。待冷卻到 60℃,加 10mL 10× MOPS電泳液和 18mL 37%甲醛至終濃度為 2.2mol/L?；靹蚝?澆板,插梳。 取 RNA 20～30 μg溶于 4.5μL DEPC處理的蒸餾水,加2μL10× MOPS電泳液 3.5μL,甲醛 10μL甲酰胺 (終體積為20 μL)。變性溫度為 65℃,15min。樣品變性后立即置于冰浴。加上樣染色液,上樣。將變性瓊脂糖凝膠裝入含有 1× MOPS電泳緩沖液的電泳槽(經 3%過氧化氫處理)中。預電泳 5min,加樣品。電泳,50V,3h。電泳后,EB染色,照像(用薄膜包膠 )。

1.4.4.5 RT-PCR實驗步驟:將 RT-PCR試劑盒從-80℃冰箱取出,復融,將 5×逆轉錄 buffer,dNT Ps,MM LV,上游引物 F,下游引物 R,10 000r/min,數秒。將經過稀釋后的 RN A樣本進行 RT,反應體系為:5×逆轉錄 buffer4μL、上游引物 F 0.4 μL、下游引物 R 0.4μL、dN TPs 0.2 μL、逆轉錄酶 MM LV 1μL、DEPC處理水 10 μL、RNA模板 4μL,總體積 20μL。依次插入預先設置(37℃ 1h、95℃ 5min)加熱模塊。逆轉錄 cDN A完成,放入-80℃冰箱備用。

1.4.4.6 FQ-PCR檢測實驗步驟:取出實時熒光定量PCR試劑盒(達安公司 )解凍,取出消毒好的 96孔聯體反應板,分別加入 cDNA模板。 依次加入 Taq酶 1μL、dN TPs0.5μL、上、下游引物各 0.5μL、熒光標記探針 0.5μL、5×buffer 10 μL、ddH2O 32μL、cDNA 5 μL,總體積 50 μL。放入全自動實時熒光定量 PCR儀(美國 ABI7300)板槽中。擴增條件:50℃ 2min,95℃ 10min,95℃ 15s、60℃ 1min,共 40個循環,反應完數據保存。

1.5 統計學方法 采用 SPSS11.0統計軟件包對相關數據進行統計分析。在統計過程中進行了正態分布檢驗和方差齊性檢驗,數據滿足方差分析條件,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用 t檢驗,P＜0.05具有統計學意義。

2 結 果 2.1 復黃膏對糖尿病大鼠創面閉合指數的影響 在用藥第 3天和第 11天,模型組的創面閉合指數均明顯低于創面對照組(P＜0.05);復黃膏組的創面閉合指數則明顯高于模型組(P＜0.05),與創面對照組相當(P＞0.05)。見表1。

表1 復黃膏用藥第 3天和第 11天對大鼠糖尿病創面閉合指數的影響(±s,%)

表1 復黃膏用藥第 3天和第 11天對大鼠糖尿病創面閉合指數的影響(±s,%)

△P＜0.05,vs創面對照組;▲P＜0.05,vs模型組

創面閉合指數組 別 n 3rd day 11th day創面對照組 7 3.11±1.53 77.62±10.00模型組 6 0.78±0.57△ 42.39±9.78△復黃膏組 6 2.36±1.30▲ 78.01±8.85▲

2.2 復黃生肌愈創油膏對糖尿病大鼠創面中 TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA表達影響 創面修復 3d時,復黃膏組創面中 TGF-β1mRN A表達量均明顯高于模型組(P＜0.05),但和創面對照組比較無統計學差異;Ⅰ、Ⅲ型膠原 mRN A表達量 3組間比較無統計學差異。見表 2。創面修復 11d時,復黃膏組創面中 TGF-β1和Ⅰ型膠原 mRNA表達明顯低于創面對照組(P＜0.05),但和模型組比較無統計學差異;復黃膏組Ⅲ型膠原 mRNA表達明顯高于模型組(P＜0.05),但和創面對照組比較無統計學差異。見表 3。

表2 復黃生肌愈創油膏對糖尿病大鼠創面3dT GF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原m RNA水平影響 (±s,%)

表2 復黃生肌愈創油膏對糖尿病大鼠創面3dT GF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原m RNA水平影響 (±s,%)

▲P＜0.05,vs模型組

Group n TGF-β 1 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原創面對照組 7 2.82± 3.08 2.37± 2.85 2.80± 3.55模型組 6 1.10± 1.23 1.98± 1.14 0.69± 0.62復黃膏組 6 4.76±3.63▲ 1.49± 1.32 2.49± 3.26

表3 復黃生肌愈創油膏對大鼠糖尿病創面 11d T GF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原m RNA水平影響(±s,%)

表3 復黃生肌愈創油膏對大鼠糖尿病創面 11d T GF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原m RNA水平影響(±s,%)

△P＜0.05,vs創面對照組;▲P＜0.05,vs模型組

Group n TGF-β1 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原創面對照組 7 2.69± 1.63 7.16± 5.93 2.33± 1.98模型組 6 0.33± 0.30* 0.87± 0.62* 0.45± 0.24復黃膏組 6 0.53± 0.32* 1.77± 0.99* 3.56± 2.31▲

3 討 論 復黃生肌愈創油膏是根據糖尿病潰瘍“虛甚瘀重,瘀甚虛重”的病機立法,以祛瘀扶正,方以大黃、蛋黃油為主藥,一以活血祛瘀,一以扶正生肌;以紫草、血竭助大黃祛瘀止痛,珍珠粉等助蛋黃油生肌收口,佐以龍骨收瘡斂口,麻油生肌潤膚;象皮斂瘡生肌 ,促進局部傷口愈合。全方合用,有活血祛瘀、生肌收口之功效,在臨床促進難愈性創面愈合治療上取得了一定的療效[4]。本實驗中動物模型創面閉合指數結果顯示,復黃膏組的效果接近創面對照組。 TGF-β是成纖維細胞的強效趨化因子,可以通過旁分泌和自分泌直接或間接、單獨或協同、同時或不同時相作用于炎癥及修復細胞,產生細胞的趨化性遷移、增生分化,細胞外基質合成及分泌三類重要的生物學效應。陳偉等[5]研究發現:機體內 TGF-β的 3種異構體的生物學功能不盡相同,與 TGF-β2、β3相比 ,TGF-β1與傷口修復愈合的關系最為密切。創面修復延遲的原因可能是由于潰瘍處的TGF-β1因子含量下降 ,而 TGF-β2和 TGF-β3蛋白表達增強 ,引起肉芽生長緩慢,血液供應不足,基質纖維蛋白代謝失調等,最終導致潰瘍的發生[6]。用藥 3d時,實驗結果表明:復黃膏組 TGF-β1mRNA百分比數值明顯高于模型組,P＜0.05,但和創面對照組比較無統計學差異 ,與 TGF-β1蛋白檢測結果一致。提示復黃生肌愈創油膏在創面愈合早期可以促進糖尿病難愈性創面中 TGF-β1的分泌,從而達到促進創面愈合的作用。在已知的細胞因子中 TGF-β被公認為是最重要的致纖維化細胞因子,是促進成纖維細胞表型轉換的重要因子。抑制 TGF-β1的生物學作用可降低成纖維細胞增殖,有助于改善增生性瘢痕的形成,對萎縮性瘢痕的治療有一定的指導意義。用藥 11d時,實驗結果表明:復黃膏組創面中 TGF-β1mRNA含量明顯低于創面對照組(P＜0.05),但和模型組比較無統計學差異;與 TGF-β1蛋白檢測結果一致。提示復黃生肌愈創油膏在創面愈合后期可能具有抑制糖尿病難愈性創面中 TGF-β1分泌的作用,從而降低纖維細胞過度增殖,減少瘢痕形成。

膠原在創傷修復中是構成修復組織的主要細胞外基質成分,對于修復過程的完成有著極其重要的作用。愈合初期成纖維細胞被激活,合成和分泌膠原,膠原的產生既是創面修復的重要過程,也是瘢痕形成過程的決定性因素,故調控膠原的合成對于促進創面愈合,減少瘢痕形成有著重要的意義。膠原在創面修復過程中,作為修復質量的終結指標,決定著創面是否能順利修復,以及修復質量高低[7]。而膠原的類型很多,其中含量最豐富的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原,在創面愈合過程中,Ⅰ、Ⅲ型膠原起著重要作用。Ⅰ型膠原纖維直徑為 100～ 500 nm,Ⅲ型膠原直徑為 40～60 nm,愈合的傷口中Ⅲ型膠原出現得比Ⅰ型膠原早[8]。Ⅲ型膠原含量越高 ,膠原纖維越細,彈性越好,說明瘢痕的纖維化程度越低,膠原纖維就越細,形成的瘢痕就越輕,故提高Ⅲ型膠原比例是減少瘢痕的重要手段[9]。本研究結果顯示,在創面修復的第 3天 ,3組間Ⅰ型膠原 mRNA的表達無明顯差異,但Ⅲ型膠原 mRNA的含量復黃膏組明顯高于模型組(P＜0.05);在創面修復的第 11天,復黃膏組創面中Ⅰ型膠原mRN A表達明顯低于創面對照組(P＜0.05),但和模型組比較無統計學差異;復黃膏組Ⅲ型膠原 mRNA表達明顯高于模型組(P＜0.05),但和創面對照組比較無統計學差異。提示應用復黃膏具有促進Ⅰ型、Ⅲ型膠原增生作用,尤其在創面愈合早期就可促進Ⅲ型膠原的表達,后期可以部分抑制Ⅰ型膠原的表達,這可能是其促進創面愈合、減少瘢痕形成的主要機制之一。因此,復黃膏有可能通過促進糖尿病潰瘍創面Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖及調節二者的平衡,從而發揮其促進創面愈合的作用。

綜上,復黃生肌愈創油膏在糖尿病潰瘍創面愈合過程中可能通過影響 TGF-β1mRN A的分泌,從而調節Ⅰ、Ⅲ型膠原不同時段的表達,起到促進創面愈合的作用,同時可一定程度上減少瘢痕形成。

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