菲律賓蛤仔糖蛋白提取及體外抗腫瘤活性研究

郁 迪，楊永芳，王加斌，楊最素，黃芳芳，鄭玉寅，李 榮，丁國芳*

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山 316004；2.浙江海力生制藥有限公司，浙江舟山 316021）

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum，屬軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、簾蛤科Veneridae，山東稱蛤蜊，廣泛分布在我國南北海區。菲律賓蛤仔肉蛋白質量較高，脂肪含量較低，且含維生素和微量元素豐富，是較好的海洋生物功能食品。最新研究結果表明，菲律賓蛤仔肉組織中的所含的活性物質具有抗癌、改善癥狀、延長病人生命、提高免疫力、抗動脈粥樣硬化等作用[1-3]。糖蛋白廣泛存在于生物體內，是蛋白質和糖類的共價復合物，具有很多重要功能。它既是激素、凝集素、酶、毒素、病毒和細菌等的識別點，也是細胞表面抗原、糖分化抗原和癌發育抗原，在細胞信號轉導過程中具有十分重要的作用[4-6]，目前，從海洋生物中分離純化得到糖蛋白并研究其抗癌作用已有報道[7-9]。筆者經離子交換和凝膠層析等方法分離純化得到具有較強活性的糖蛋白，并對其化學結構及體外對人腫瘤細胞的增殖抑制活性進行了初步研究,以期為菲律賓蛤仔的深度開發提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

菲律賓蛤仔采于舟山活鮮市場，經專家鑒定后，取其肉，立即冷藏于-20℃冰箱備用。DEAE SepharoseFF陰離子交換柱購自于北京亞太恒信生物科技有限公司；MTT試劑盒、培養基和胰蛋白酶購于sigma公司，二甲基亞砜購于美國amresco公司；Sephadex G-25凝膠購自上海如吉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

采用HD-21-88蛋白檢測儀、BSZ-40-LCD自動部分收集器、BSA124S型電子天平、DS-1型高速組織搗碎機、Nicolet is10紅外光譜儀、CF16RXII高速冷凍離心機；U2800型紫外可見分光光度計、ZHJHC1209C型超凈工作臺、Forma 3111型CO2培養箱、Olympus倒置顯微鏡、Bio-Rad酶標儀等。

1.3 菲律賓蛤仔糖蛋白提取純化工藝

1.3.1 糖蛋白提取

將300 g蛤肉組織機械絞碎，然后加3倍體積蒸餾水，90℃水浴抽提4 h，2層紗布過濾。將殘渣加3倍體積蒸餾水，90℃水浴抽提3 h，兩層紗布過濾，合并2次濾液。3 000 r/min離心10 min，收集上清液。50℃減壓濃縮至800 mL，加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜。小心傾去上清液，收集沉淀。然后4℃下5 000 r/min離心10 min收集沉淀。將沉淀真空冷凍干燥，得粗提物。

1.3.2 粗提物的色譜分離純化

準確稱取干燥物樣品4.3 g，室溫下加入200 mL去離子水溶解搖勻。取氯仿—正丁醇(體積比為4∶1)溶液40 mL加入溶液中，4℃靜置過夜。將上清液倒出，重復上述過程，共計2次。將上清液冷凍干燥，然后過DEAE SepharoseFF離子交換層析柱，NaCl溶液洗脫分3個濃度進行，分別為：0.1、0.3和 0.5 mol/L，洗脫速度1 mL/min，每管4 mL進行收集，紫外280 nm檢測蛋白峰，同時采用苯酚-硫酸法檢測糖峰，收集峰值洗脫液，用Sephadex G-25凝膠柱除鹽，冷凍干燥后備用。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

采用15%的SDS-PAGE電泳膠，考察純化后糖蛋白的電泳行為，用考馬斯亮藍法進行染色。

1.5 糖蛋白理化性質分析

1.5.1 糖與蛋白含量測定

糖含量測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品；蛋白含量測定采用Folin-酚法，以牛血清白蛋白作為標準品。

1.5.2 紫外和紅外光譜

紫外光譜掃描范圍為190～490 nm，檢測峰值所在波長。紅外光譜采用溴化鉀壓片法，在400～4000 cm-1之間掃描。

1.6 菲律賓蛤仔提取純化物活性測定

1.6.1 細胞培養

取購自中國科學院上海生物細胞所細胞庫的DU-145細胞株，由本實驗室傳代保存，用10%小牛血清的RPMI1640完全培養基于溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養箱中培養至對數生長期。

1.6.2 測定細胞增殖抑制率

檢測用MTT法。菲律賓蛤仔糖蛋白溶液的配制濃度分別為5、10、15、20、25、30 mg/mL。取對數生長期的細胞制成懸液，接種于96培養孔板中，每孔為200 μL，培養于CO2濃度為5%、培養箱溫度為37℃，貼壁4 h，之后分別加入不同濃度的菲律賓蛤仔糖蛋白溶液，每種濃度建3個平行孔，同時設對照組進行對照，在5%的CO2、37℃培養箱中孵育48 h，然后加MTT繼續培養4 h，再吸去MTT，在酶聯免疫檢測儀上490 nm測吸光度，計算IR（細胞增殖抑制指數），計算公式見下：

IR=[(對照組A值-藥物組A值)/對照組A值]×100%

1.7 數據處理

每個組測定的實驗數據均做3個平行實驗，取平均值為其結果。

2 結果

2.1 分離純化

經水提醇沉后共得到6.5 g糖蛋白粗品。取4.3 g離子交換后得到1、2和3共3個峰，分別經紫外和苯酚-硫酸法檢測，其中，峰2的蛋白峰和糖峰重合較好，且該峰峰值最高（圖1），為 0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫組分，收集該峰，經Sephadex G-25凝膠除鹽，冷凍干燥后得到1.96 g白色粉末狀易吸潮物質，得率為0.98%。

圖1 糖蛋白DEAE-SepharoseFF洗脫圖譜Fig.1 Elution peak of DEAE-sepharoseFF

2.2 SDS-PAGE 電泳數據結果

峰2組分經SDS-PAGE電泳，Bradford染色顯示為單一條帶，如圖2。

圖2 糖蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of glycoprotein

2.3 理化性質

經檢測，圖1中峰2組分的糖含量為53.13%，蛋白含量為38.64%，易溶于水；紫外全波長掃描顯示，峰2組分在268 nm處有特征吸收，如圖3；紅外光譜掃描結果表明，在3 290.10 cm-1處，有羥基伸縮振動峰，2 940.04 cm-1處，是 CH伸縮振動峰，這2個峰是糖類化合物典型的特征吸收峰；1 629.07 cm-1附近有強吸收,示有酰胺鍵的C=O鍵伸縮振動及N-H鍵的變角振動，是蛋白典型吸收峰；1 419.54 cm-1是COO-的吸收峰；1 000～1 200 cm-1是C-O-C和C-O-H伸縮振動。在840 cm-1附近無吸收峰，在880 cm-1有吸收峰，說明多糖部分可能以β-糖苷鍵連接[10-11]。光譜掃描結果表明，本實驗所提取的峰2組分是糖和蛋白的復合物。

圖3 糖蛋白全波長紫外掃描圖Fig.3 Ultraviolet spectra of glycoprotein

2.4 菲律賓蛤仔糖蛋白對DU-145細胞增殖的作用

不同濃度的菲律賓蛤仔糖蛋白作用于DU-145細胞48 h后，癌細胞出現明顯的增殖抑制現象，而且隨著濃度的增加抑制率逐漸增大，半數抑制濃度約為15.56 mg/mL，當濃度為30 mg/mL時，抑制率達到72.49%，見表1。

3 討論

本實驗中的提取物峰2組分在陰離子交換層析圖譜中顯示糖峰和蛋白峰完全重合，經Bradford染色電泳圖中顯示為單一條帶，紅外光圖譜顯示其具有糖和蛋白的特征吸收峰，因此判斷該提取物可能為純度較高的單一糖蛋白。該糖蛋白體外對DU-145細胞具有顯著的增殖抑制活性，當濃度為15～25 mg/mL時，對癌細胞的增殖抑制作用明顯增強，之后趨于平緩，因此判斷糖蛋白對DU-145細胞的最適作用濃度約為25 mg/mL。由于糖蛋白的結構和活性功能比單純的糖類和蛋白質類復雜，因此對于本實驗中所提取的糖蛋白的分子量和一級結構還有待于進一步研究。此外，為了全面評價抗前腺癌活性，還應測定其對前列腺癌細胞其它瘤譜的抑制作用，并且進行體內實驗和活性作用機理研究對于將其開發成藥品或保健品也是必不可少的環節。

表1 糖蛋白對前列腺癌細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibit rate of glycoprotein from peak1 on Prostate cancer cell

[1]范秀萍,吳紅棉,王婭楠,等.菲律賓蛤仔糖胺聚糖的免疫活性研究[J].食品科學,2008,29(4):370-372.

[2]KEISUKE G T,TAKUO K,KIYOKUN M.Purification and antibacterial characterization of a novel isoform of the Manila clam lectin(MCL-4)from the plasma of the Manila clam,Ruditapes philippinarum[J].Comp Biochem Physiol,2008,150:45-52.

[3]張 莉,劉萬順,韓寶芹,等.菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)蛋白聚糖的分離提取及其抗腫瘤活性的初步研究[J].海洋與湖沼,2007,38(1):62-68.

[4]肖 瑩.糖蛋白生物活性研究綜述[J].現代農業科學,2009,16(4):31-32.

[5]郭 慧,鄧文星,張 映.糖蛋白的研究進展[J].生物技術通報,2009(3):16-19.

[6]ESTAQUIER J,BLOY C,CORALLO F,et al.The immunomodulating glycoprotein extract from Klebsiella pneumoniae RU 41740 exerts a suppressive effect on human monocyte death byapoptosis[J].Immunopharmacology,1998,39(2):157-164.

[7]張 柏,吳梧桐.抗腫瘤文蛤糖肽(MGP0405)的分離純化及性質研究[J].中國天然藥物,2006,4(3):230-233.

[8]顧謙群,方玉春,辛現良,等.櫛孔扇貝糖蛋白的腫瘤抑制活性和對免疫功能的影響[J].營養學報,2001,23(3):200-202.

[9]韓雅莉,謝 昆.土鱉蟲糖蛋白的提取及抗腫瘤活性初步研究[J].汕頭大學學報：自然科學版,2006,21(4):46-50.

[10]徐明生,曾婷婷,蔣 艷,等.河蜆免疫活性糖蛋白分離及結構初步分析[J].食品科學,2008,29(11):157-160.

[11]陳登龍,房 乾,姚清華,等.傅里葉紅外光譜研究重組蛛絲蛋白分子構象的影響因素[J].高分子材料與工程,2009,25(1):104-110.