黃芪注射液對阿霉素中毒性心肌損傷小鼠心肌細胞線粒體膜電位及GSH的影響*

梁麗英 陳 晶 賀 毅

阿霉素（adriamycin，ADM）用于治療各種惡性腫瘤。但是，由于其具有明顯的心臟毒性，臨床應用受到限制。阿霉素心臟毒性與心肌細胞凋亡有關，在細胞凋亡過程中，線粒體起著關鍵性的作用。研究發現，在細胞凋亡的早期階段，細胞發生病理改變前，線粒體膜電位就已經下降，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉[1]。黃芪注射液對細胞線粒體膜電位下降有抑制作用[2]。本研究旨在探討其拮抗阿霉素心臟毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 阿霉素（注射用鹽酸多柔比星10 mg/瓶，浙江海正藥業股份有限公司，批號：090201B）；黃芪注射液（2 g/mL，正大青春寶有限公司，批號：0901073）。JC-1細胞線粒體膜電位試劑盒（5 mg/瓶，美國Biovision，批號：ENZ-52304）。還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（100T，批號：20100302，南京建成生物工程技術有限公司）。

1.2 實驗動物 昆明小鼠60只（廣西醫科大學動物實驗中心，SCXK桂-2003-0003），雄性，清潔級，體質量18～20 g。

1.3 儀器設備 流式細胞分析系統（美國BECKAN COUL?TER公司，型號：Epics XL）；移液器（德國EPPENDORF公司）；756型紫外分光光度計（上海菁華儀器廠）。

1.4 實驗方法 采用隨機平行同期對照的方法，建立小鼠阿霉素中毒性心肌損傷（ADR）動物模型。60只小鼠按隨機數字表分為黃芪注射液治療組（大、中、小3個劑量組）、阿霉素模型組和正常對照組。正常對照組每日腹腔注射生理鹽水10 μL/g；阿霉素模型組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g；黃芪注射液治療組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g，另外大、中和小劑量組每日腹腔分別注射黃芪注射液12、6和3 μg/g。所有動物均自由飲食。連續給藥14 d。

1.5 檢測指標與方法 （1）心臟系數測定：稱取小鼠體質量，摘眼球取血，處死后取出心臟，用電子分析天平準確稱量全心濕質量，計算心臟系數（全心濕質量/體質量）。（2）心肌組織中GSH的檢測：取心肌約50 mg，置于預冷的PBS中，洗去殘留血液，用濾紙吸干水分，在4℃冰浴中制備10%的心肌組織勻漿，低溫離心3 000 r/min，30 min，取上清比色法檢測GSH。（3）心肌細胞線粒體膜電位檢測：取心臟約50 mg，制成單細胞懸液，調整細胞數的濃度為106個/mL。用流式細胞儀檢測，將100 μL細胞懸液（106個/mL）加入5 mL的流式測定管中，同時設立陰性對照管。在測定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對照管不加。輕輕混勻。將測定管和對照管置于37℃培養箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管和對照管中，上機檢測。流式細胞儀激發波為488 nm，紅色熒光的最大發射波長為580/590 nm，綠色熒光的最大發射波長為510/527 nm，以紅/綠熒光強度比值代表細胞線粒體膜電位，圖像采用Cell Quest軟件分析。

1.6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 13.0軟件對數據進行單因素方差分析，以均數±標準差±s）表示，方差不齊時采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心臟系數結果 各組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P<0.01）；與正常對照組比較，黃芪注射液小劑量組心臟系數偏大，差異有統計學意義（P<0.05），與黃芪注射液大劑量組、中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）,見表1。

2.2 心肌組織中GSH檢測結果 各組分別與阿霉素模型組比較差異均有統計學意義（P<0.01）；黃芪注射液各劑量組相互比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 線粒體膜電位 阿霉素模型組與其他各組比較差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；黃芪注射液各劑量組與正常對照組比較，差異也有統計學意義（均P<0.01），見表3。

表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數的影響 ±s）

表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數的影響 ±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 4.11±0.10 4.44±0.14 4.18±0.13 4.21±0.16 4.24±0.18 7.140**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001 0.193 0.104 0.036<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001 0.003 0.624 0.411 0.738統計學處理組別 n 心臟系數（mg/g）

表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 3.99±0.47 2.02±0.22 2.77±0.16 2.88±0.56 2.67±0.28 36.118**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001<0.001 0.609 0.550 0.270統計學處理組別 n GSH（mg/g）

表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 1.86±0.22 0.88±0.27 1.43±0.16 1.33±0.18 1.07±0.14 40.523**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001 0.027組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P 0.001<0.001 0.002<0.001 0.211統計學處理組別 n線粒體膜電位（FL2/FL1）

3 討論

心肌細胞凋亡可直接導致心臟動力來源減少,凋亡細胞局部纖維化可誘發心律失常。線粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potential）紊亂是細胞凋亡時發生的細胞內事件之一，是細胞凋亡過程中的重要事件，其可導致在線粒體膜上形成孔洞，細胞色素C釋放到細胞質中。線粒體內容物釋放的調控被認為與線粒體膜上一種稱為permeability transition pore（PT pore）的線粒體膜通透性轉運孔有關，此孔道打開會造成線粒體內膜兩側H+梯度消失、線粒體膜電位下降，造成線粒體漲大，外膜漲破之后細胞色素C釋放到細胞液中引起細胞凋亡[3]。線粒體膜電位下降是細胞凋亡的特征性標志，維持正常的線粒體膜電位是抑制細胞凋亡的重要手段[4]。本研究選用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1），它是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質（ma?trix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體（monomer），可以產生綠色熒光，這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。紅綠熒光的相對比例常用來衡量線粒體膜電位。本研究結果顯示，黃芪注射液能穩定心肌細胞膜電位，抑制膜電位下降，減緩心肌細胞凋亡。

線粒體是能量產生的重要場所，在產生能量的同時也會產生大量的氧自由基（ROS），ROS過多會造成線粒體損傷、膜電位下降、線粒體膜通透性轉換孔開放和細胞色素C等凋亡相關因子釋放[3]。GSH參與體內氧化還原過程，能和過氧化物及自由基結合，以對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，是人體組織中用于清除ROS的抗氧化劑。GSH不僅參與細胞抗氧化反應、維持機體的氧化還原平衡，還參與了調節細胞增生、機體免疫應答。GSH降低是潛在的凋亡早期激活信號，隨后產生的ROS促使細胞發生凋亡，即細胞發生凋亡時，細胞漿內的GSH水平會降低[5]，因此檢測GSH水平可以判斷和檢測細胞凋亡。本研究結果顯示黃芪注射液可提高ADR小鼠細胞漿內GSH，保護心肌細胞，抑制細胞凋亡。

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