HIF-1α在進展性腎炎大鼠腎小管間質中的表達及ARB的干預作用

査 艷，胡 英，沈 燕，黃朝暉，俞 雷

(1貴州省人民醫院，貴陽550004;2貴州省電力醫院)

腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病致腎衰竭的主要病理改變和共同通路。“慢性低氧學說”是目前腎臟病學界的研究熱點，其認為腎小管間質細胞的慢性氧缺失是促進腎臟纖維化的重要原因［1］。目前氯沙坦除用于降壓外，還用于臨床延緩腎功能不全進展的治療，但其對腎臟保護作用的具體機制尚不完全清楚。2008年10月～2010年10月，我們檢測了低氧誘導因子(HIF-1α)在進展性腎炎大鼠腎小管間質中的表達及氯沙坦的干預作用，旨在探討氯沙坦在慢性低氧狀態下對腎小管間質的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠(重慶騰鑫生物技術公司提供，二級)25只，體質量(126.7±10)g。氯沙坦購自杭州默沙東制藥公司，小鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購于美國Neo Markers公司，小鼠抗人HSP47單克隆抗體購于加拿大Assay Designs Stressgen公司。總RNA提取Trizol試劑購于美國 Gibco-BRL公司，辣根過氧化物酶標記抗兔二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。全自動多功能生化分析儀(日本Hitachi公司);SN-628放射免疫γ計數儀(中國科學院上海原子核研究所);光學顯微鏡(日本O-lympus公司)。

1.2 造模及干預 將25只大鼠隨機分為假手術組、模型組、未給藥組、小劑量組、大劑量組各5只，假手術組只做腎包膜剝離，不做腎臟切除;后四組均參照文獻［2］制作進展性腎炎致腎小管間質纖維化模型，行右腎摘除術;術后第1、2周于鼠尾靜脈注射IgG(OX-7)標記小鼠單克隆抗Thy1.1抗體1.2 mg/kg 2次;2周后未給藥組、小劑量組、大劑量組則分別予氯沙坦0、20、80 mg/(kg·d)入飲水中灌胃至8周，除模型組于4周時麻醉下處死大鼠外，余組均8周時處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標本。

1.3 相關指標檢測 ①收縮壓(SBP)。采用普升科技有限公司鼠尾無創血壓測量儀LE5001測鼠尾SBP。②24 h尿蛋白定量。應用雙縮脲法測定。③血肌酐(SCr)。采用日本Hitachi公司全自動生化分析儀用化學法測定。④腎組織病理改變及腎間質面積。5%中性甲醛固定腎組織，常規HE、PAS、PAM、MASSON染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。200倍光鏡下每個標本選取選10個腎小管間質視野(避開腎小球和大血管)，每個視野分別測量腎間質面積與統計場面積的比值。采用顯微圖象分析系統(Olympus C3040-ADU)對各組染色結果進行積分光密度(IOD)測定，每張切片隨機選取10個高倍視野(200倍)，每個視野代表0.13 mm2的區域面積，計算其IOD值，取平均值。⑤HIF-1α、熱休克蛋白47(HSP47)mRNA表達測定。采用原位雜交法。取3 μm厚石蠟切片，常規脫蠟至水，滅活內原性酶，熱修復抗原，抗原抗體反應，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。HIF-1α、HSP47mRNA原位雜交所用探針為經地高辛標記的針對HIF-1α、HSP47基因的多相寡核苷酸探針，操作步驟按試劑盒說明書進行。陽性產物呈深紫色，不加探針為陰性對照。HIF-1α、HSP47 mRNA表達以IOD值表示，數量級為×103。⑥相關性分析。對腎小管間質中HIF-1α、HSP47 mRNA表達行Pearson相關性分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件，計量數據用±s表示，組間比較行t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組相關指標檢測結果見表1。PAS染色示假手術組腎小管間質形態基本正常，模型組見腎小管上皮細胞萎縮、部分腎小管擴張、間質水腫，炎癥細胞浸潤并出現纖維化;未給藥組大部分腎小管上皮細胞脫落，管腔擴張，管型堵塞，間質炎癥和纖維化進行性加重。小劑量組腎小管間質損傷得到改善;大劑量組腎小管間質損傷得到顯著修復。HIF-1α mRNA表達主要集中于腎小管上皮細胞的胞質，HSP47 mRNA表達主要集中于腎小管上皮細胞和間質細胞的胞質。相關分析示HIF-1α與HSP47 mRNA 表達呈正相關(r=0.794，P ＜0.01)。

3 討論

表1 各組相關指標檢測結果(n=5，±s)

表1 各組相關指標檢測結果(n=5，±s)

注:與假手術組比較，◆P ＜0.01;與未給藥組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.01，★P ＜0.05;與小劑量組比較，▲P ＜0.01，◇P ＜0.05

mRNA HSP47 mRNA模型組 135±6◆ 101.22± 9.67◆ 156.54± 9.86◆ 0.18±0.03◆ 28.53±4.08◆ 44.52±4.27組別 SBP(mmHg) SCr(μmol/L) 尿蛋白(mg/d) 腎間質面積 HIF-1α◆0.34 1.76 ±0.23未給藥組 148±5 163.04±13.45◆ 297.32±26.29◆ 0.26 ±0.05◆ 46.32 ±6.34◆ 53.92±5.01◆低劑量組 127±4 79.15± 3.93△★ 109.42± 7.49 0.13 ±0.02△ 20.28 ±2.73△ 26.49±3.06△大劑量組 101±5△★ 64.73± 4.92△＊ 53.21± 6.05△＊◇ 0.10 ±0.01△＊ 9.46 ±2.25△＊▲ 11.05±2.46△＊▲假手術組 112 ±3 56.35 ± 3.78 21.26 ± 3.07 0.08 ±0.01 2.36 ±

研究發現，慢性缺氧是導致腎小管間質纖維化的主要因素之一［3］。低氧刺激產生的許多蛋白分子與腎纖維化密切相關，如低氧可使人近曲小管上皮細胞、人腎臟成纖維細胞TGF-βmRNA表達增加［4］，促進細胞外基質合成、抑制細胞外基質降解［5］。HIF-1屬于轉錄因子，是由 α/β 兩個亞基形成的異源二聚體。HIF-1α在體內特異地受氧濃度調節，當體內氧濃度下降時，HIF-1α迅速在細胞內積聚使細胞內水平增加;當恢復正常氧濃度時，HIF-1α蛋白很快被泛素降解;而HIF-1α對低氧不敏感，故HIF-1α蛋白可作為低氧的指標［6］。腎小管間質纖維化的重要特征是腎間質膠原蛋白合成和沉積增加。HSP47是一種膠原特異性的“分子伴侶”，在膠原生物合成過程中協助前膠原修飾、折疊、裝配，其表達增加與間質過度積聚膠原有密切關系［7～9］。但慢性低氧在進展性腎炎中能否誘導腎小管間質細胞HSP47表達尚未見文獻報道。

進展性腎炎大鼠［2］是目前觀察慢性腎臟病進展較理想的動物模型，該模型于4～11周小管間質的有效循環血流量下降近40%，出現持續的腎小管間質缺血缺氧，有利于觀察低氧狀態對腎臟的損害。本研究結果顯示，模型組SBP、SCr、24 h尿蛋白均明顯高于假手術組，術后腎小管灶狀萎縮，出現間質纖維化，表現出與人類腎臟纖維化一致的病理過程，與 Matsumoto［2］研究結果一致。

氯沙坦為血管緊張素受體拮抗劑(ARB)，可競爭性抑制AngⅡ與其受體結合，且主要與AT1結合，阻斷AngⅡ引起的血管收縮、交感興奮、醛固酮分泌增多等作用，因而可以緩解腎損傷［10］。本研究發現，通過應用不同劑量的氯沙坦治療4周后，SCr、24 h尿蛋白均較模型組明顯減少，但大劑量組SBP與假手術組比較無顯著差異，說明在保證血流動力學穩定情況下，大劑量氯沙坦可明顯減少尿蛋白，改善腎功能。

已有研究表明，進展性腎炎大鼠腎臟組織中存在小管間質持續性的炎癥和缺血、缺氧。本研究結果顯示，模型組及未給藥組HIF-1α均明顯高于假手術組，說明在發生小管間質纖維化前腎小管存在明顯缺氧，與Manotham等［11］報道一致。目前雖無研究證實HIF-1α可直接通過調節HSP47表達，參與腎臟膠原合成增加致腎纖維化。但Kimura等［12］通過制作 pVHL-/-基因敲除小鼠發現 60周齡的pVHL-/-小鼠腎間質纖維化面積明顯增加，注射HIF-1α拮抗劑YC-1后可抑制pVHL-/-小鼠腎纖維化的進展。因此認為抑制HIF-1α表達是治療腎臟纖維化的新靶點。已有研究結果證實，氯沙坦能通過減少轉化生長因子β1的表達來減輕腎臟纖維化［13］。本研究結果顯示，經氯沙坦治療4周后，進展性腎炎大鼠腎小管間質纖維化顯著改善，HIF-1α及HSP47表達降低，可見在保證血流動力學穩定情況下，大劑量氯沙坦不但能抑制，而且還可一定程度逆轉腎小管間質的纖維化進展。

綜上所述，氯沙坦可能通過干預進展性腎炎大鼠HIF-1α表達而發揮腎臟保護作用。

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