AngⅡ對人臍靜脈內皮細胞BMP-2表達的影響

鄔梅芳 彭道泉 丁家崇

(1.湖南省老年醫院心內科; 2.湘雅二醫院心內科 長沙 410016)

近期研究表明動脈粥樣硬化的鈣化具有骨鈣化的特征[1],骨形態發生蛋白-2(BMP-2)作為轉化生長因子β細胞因子超家族成員中的一員,在骨形成和骨愈合過程中是不可缺少的細胞因子。在人動脈粥樣硬化的鈣化斑塊中發現有BMP-2的mRNA的表達,所以進一步推測BMP-2與人動脈粥樣硬化的發生和發展密切相關[2～3]。

RAS系統及其主要活性物質血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在動脈粥樣硬化發生發展中居于核心地位,起著關鍵性作用。但其與BMP-2的關系的研究卻鮮有報道,本研究通過體外細胞培養用AngⅡ刺激細胞同時用其拮抗劑厄貝沙坦干預來研究BMP-2表達的影響,并用免疫組織化學法來測定NFkb-P65的表達,初步探討其可能機制。

表1 不同濃度AngⅡ及厄貝沙坦干預后對HUVECs上清液中BMP-2濃度的影響(±s)

表1 不同濃度AngⅡ及厄貝沙坦干預后對HUVECs上清液中BMP-2濃度的影響(±s)

注:與對照組(0μmol/L AngⅡ)相比,*P<0.01;與厄貝沙坦干預組比較,△P<0.01

組別(n=4) BM P-2(pg/m L)0μm ol/L A ngⅡ 14.76±1.44 5μm ol/L A ngⅡ (31.49±2.31)＊10μm ol/L A ngⅡ (38.41±2.81)＊20μm ol/L A ngⅡ (78.51±2.16)＊,△20μm ol/L A ngⅡ+5μm ol/L 厄貝沙坦 22.62±2.47

1 對象與方法

1.1 實驗對象

人臍靜脈內皮細胞株。

1.2 實驗方法

HUVECs的體外培養(方法略),選擇3～4代HUVECs進行轉板長滿后隨機分為5組給予不同濃度的AngⅡ、厄貝沙坦,干預48h后觀察對BMP-2的表達的影響,具體如下:藥物終濃度分別為:AngⅡ0.5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,AngⅡ20μmol/L+5μmol厄貝沙坦,干預48h用ELISIA法檢測細胞上清液中BMP-2的水平,并且用免疫組織化學測定NFkb-P65亞基的核轉移。

1.3 圖象分析

采用病理圖文分析系統對切片進行分析。

表2 不同濃度的AngⅡ對HUVECs的NF-kB表達的病理圖像分析結果(±s)

表2 不同濃度的AngⅡ對HUVECs的NF-kB表達的病理圖像分析結果(±s)

注:與對照組(0μmol/L AngⅡ)相比,*P<0.01;與厄貝沙坦干預組比較,△P<0.01

組別(n=4)N F平均吸光度 陽性面積百分比0μm ol/L 0.244±0.02 0.137±0.02 5μm ol/L (0.349±0.03)＊ (0.358±0.02)＊10μm ol/L (0.644±0.02)＊ (0.740±0.04)＊20μm ol/L (0.919±0.03)＊,△ (0.926±0.05)＊,△20um ol/L+5μm ol/L 厄貝沙坦 0.561±0.02 0.730±0.03

1.4 統計學處理

采用SPSS 14.0統計軟件分析。所有資料均采用均數±標準差(±s)表示,進行正態分布性檢驗,P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 不同濃度的AngⅡ對HUVECs的BMP-2表達的影響

隨著AngⅡ濃度的升高,細胞培養基上清液中的BMP-2濃度明顯增高(P＜0.01),且有一定的濃度的依賴性,線性相關分析是正相關關系,r=0.98(P＜0.05);而給予厄貝沙坦聯合刺激細胞培養基上清液中的BMP-2濃度明顯降低(P＜0.01),具體見表1。

2.2 細胞免疫組織化學檢測HUVECs的NF-kB的表達量

細胞免疫組化結果,NF-kB在未被激活時在胞漿有所表達,受到刺激激活后可見到胞核表達。本研究發現:HUVECs在一定AngⅡ濃度刺激下,可以見到NF-KbP65的激活,表達增加。而在厄貝沙坦干預后,NF-KbP65表達的陽性減弱。病理圖文分析結果如表2:AngⅡ刺激后平均吸光度和陽性面積百分比均增加,厄貝沙坦干預后明顯下降,有統計學差異(P＜0.01)。

3 討論

動脈鈣化是動脈粥樣硬化的病理改變之一,而BMP-2作為β細胞因子超家族中的一員,與動脈鈣化關系最為密切,其在血管表達可能與氧化應激,炎癥及高血糖等代謝紊亂有關[4～5]。

AngⅡ在動脈粥樣硬化發生發展中起著關鍵性的作用,而這些作用可被其受體拮抗劑(ARB)藥物阻斷,血管鈣化一般發生于有動脈粥樣硬化的病變處,被作為動脈粥樣硬化的標志,應用于預測動脈粥樣硬化程度,但二者的發生又有不同的機制。盡管AngⅡ在AS中的研究深入透徹,但與血管鈣化的關系如何,相關研究甚少。Csiszar A[6]發現:TNF-α可誘導NF-кB激活并引起BMP-2mRNA及BMP-2蛋白表達顯著增加,認為炎性刺激以及血管內高壓力可引起H2O2介導的NF-kB激活,從而調節血管BMP-2表達。而AngⅡ被認為是致動脈硬化因子,推測其可能對BMP-2有調節作用,對此,我們做了初步的探討。

血管內皮細胞是動脈粥樣硬化病理改變的基本單元,所以本實驗選擇內皮細胞作為研究對象,并發現:一定濃度的AngⅡ可以增加細胞培養液中BMP-2的濃度,說明AngⅡ的刺激可以增加BMP-2的表達。本研究細胞免疫組化結果顯示:在AngⅡ誘導BMP-2表達增加的同時,一定濃度的AngⅡ刺激,可使NFkb-P65在細胞核內表達明顯增加,提示BMP-2表達與NF-kB的激活有關,AngⅡ刺激內皮細胞BMP-2表達的機制可能是通過NF-kB途徑來實現的。

本研究同時用ARB藥厄貝沙坦干預,發現厄貝沙坦可以下調BMP-2的表達,相應抑制NFKb-P65在胞核的表達,提示厄貝沙坦有可能是通過對抗氧化應激損傷,抑制NF-Kb通路的激活,而最終實現下調BMP-2的表達,提示厄貝沙坦具有潛在的阻止血管鈣化進展的可能,這也許提示厄貝沙坦不僅可以治療高血壓,抗動脈粥樣硬化作用,而且可能具有預防血管鈣化的作用。

4 結語

AngⅡ可以增加臍靜脈內皮細胞BMP-2表達,并呈濃度依賴性,可能與損傷臍靜脈內皮細胞,使氧化應激水平增加,而激活NFkb-p65有關。

厄貝沙坦干預能阻斷AngⅡ誘導的的臍靜脈內皮細胞BMP-2的表達,其機制可能是通過抑制NFkb通路來實現。

[1]Demer L,Watson KE,Bostrom K.Mechanism of calcification in atherosclerosis[J].Circulation,2005,111(18):2364～2372.

[2] Deneke Y,Langner K,Grewe PH,et al.Ossification in atheroscle

rotic arteries[J].Z Kardiol,2001,90(suppl 3):III-106～III-115.[3] Bostrom K.Proinflammatory vascular calcification[J].Circ Res,

2005,96 (12 ):1219～1220.

[4]Hruska KA,Mathew S,Saab G.Bone morphogenetic proteins in vascular calcification[J].Circ Res,2005,97(2):105～114.

[5] Parhami F,Bostrom K,Watson K,et al.Role of molecular regulation in vascular calcification[J].J Atheroscler Thromb,1996,3(2):90～94.

[6] Csiszar A,Smith KE,Koller A,et al.Kaley G,Edwards JG,Ungvari Z.Regulation of bone morphogenetic protein-2 expression in endothelial cells[J].Circulation,2005,111(18):2364～2372.