18F－FLT MicroPET評估順鉑對A549肺癌早期療效反應的研究

王 燕，顏成龍，郭先偉，李新平，梁克勇，唐玲玲，黃麗蓉

（1.無錫江原安迪科分子核醫學研究發展有限公司，江蘇 無錫 214063；2.無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214000）

順鉑（順氯氨鉑，cisplatin，DDP）自1978年首先在美國批準臨床使用后，迅速成為臨床癌癥治療的佼佼者［1］。它主要通過破壞癌細胞的DNA復制而發揮作用，具有療效確切、抗癌譜廣、抗癌活性高等特點。研究表明，順鉑對腫瘤抑制率可達61%～98%［2］，因其還具有與多種抗腫瘤藥的協同作用，且無交叉耐藥等特點，為當前聯合化療中最常用的藥物之一，尤其對于實體瘤和對一般化療不甚敏感的腫瘤療效較為顯著，如在肺癌治療方面，與VP－16聯合（EP方案）為治療SCLC或NSCLC的一線方案；聯合MMC、IFO（IMP方案），或 NVB等方案為目前治療NSCLC的常用方案。

1979 年 WHO（World Health Organization）確定了實體瘤雙徑測量的療效評價標準。20多年來，由于WHO標準簡單、客觀、易行，已為世界各國普遍采用，對新藥臨床試驗和不同單位之間療效比較有明顯的促進作用［3］，但也存在不少問題。隨著醫學影像技術突飛猛進的發展，利用PET活體、早期評價藥物療效成為研究熱點。小動物PET是基于PET臨床診斷技術發展起來的，可以利用正電子核素標記示蹤分子進行活體顯像，能夠無創、動態、定量地從分子水平觀察活體的生理、生化變化特點，自20世紀90年代出現以來，已廣泛應用于葡萄糖代謝研究、神經受體系統研究、腫瘤學研究等［4－8］。在腫瘤藥物藥效研究方面，MicroPET可研究人類腫瘤的動物模型，將瘤組織接種于動物的四肢、背部和肩部等，這些部位的本底值遠低于主要臟器，容易進行精確定量分析。相對于傳統用卡尺測瘤徑，計算瘤體積，根據給藥前后瘤體積變化來評價抗腫瘤藥物藥效的方法來說，消除了人為測量誤差，通過分子水平上的活體觀察可以更早、更精確地對抗腫瘤藥物的藥效進行評價。

目前應用最廣的示蹤劑是18F－FDG，但其主要反映體內葡萄糖代謝情況，不能高特異性、高選擇性地檢測腫瘤［9］。18F－FLT是一種胸腺嘧啶類似物，可以間接反映腫瘤細胞的增殖情況［10］。本工作擬利用18F－FLT MicroPET 評價抗腫瘤藥物順鉑的早期療效，并與傳統的通過測量瘤體積評價藥效的方法進行比較，再結合病理切片實驗結果，以評價18F－FLT Micro PET在抗腫瘤藥早期藥效評價方面的可行性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM－7型醫用回旋加速器：日本住友重機械工業株式會社；PET－MF－2V－IT－I型氟多功能合成模塊：北京派特生物技術有限公司；Matrx VMR型麻醉機：美國 MATRX公司；Micro－PET掃描儀：德國Inveon SIMENS公司；CURIEMENTOR 3型活度計：德國PTW公司；SEL－1型層流架：江蘇省蘇州市吳縣實驗動物設施設備廠；Lunaire Model BI0620M 細胞培養箱：美國Theron Foema公司。

1.2 主要材料與試劑

滅菌注射用水：江蘇四環生物股份有限公司；順鉑：山東魯抗藥業；RPMI1640培養液：GIBICOL產品；胰酶消化液：GIBICOL產品；小牛血清：中國科學院上海實生細胞生物技術有限公司；18F－FLT：自制，放化純度＞95%；麻醉劑異氟烷：美國Minrad公司。

1.3 實驗動物

BALB／c裸鼠：12只，雌雄各半，3～4周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物使用許可證：SCXK（滬）2007－0005，按SPF級標準飼養于江蘇省原子醫學研究所實驗動物中心層流架內。

非小細胞肺癌A549細胞：中國科學院上海細胞庫提供，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液（含100mg／L青霉素，100mg／L鏈霉素）于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。接種針和注射針均為美國BD公司醫用5號針。

2 實驗方法

2.1 A549腫瘤模型鼠的制作

取指數生長期的A549細胞，經胰酶消化液消化后，用無血清培養液調整細胞濃度為1×107／mL。無菌條件下，每只裸鼠右邊腋下注射0.2mL細胞懸液（含2×106個細胞）。裸鼠繼續飼養于SPF級標準實驗動物中心層流架內。接種后5～6周，瘤徑長到5～7mm時進行實驗。

2.2 模型鼠分組及給藥方式

12只模型鼠分為2組，一組為給順鉑藥物治療組（給藥組），一組為對照組，每組模型鼠雌雄各3只。給藥組給藥劑量為25mg／kg，對照組根據裸鼠體重，給予相當量的賦形劑。灌胃給藥，每天一次。

2.3 MicroPET掃描法評價抗腫瘤藥藥效

模型鼠給藥前先進行18F－FLT MicroPET掃描一次，給藥后第2、5、9和14d再行18F－FLT MicroPET掃描：取各組肺癌模型鼠稱重后，尾靜脈注射0.2mL（3.7MBq）18F－FLT，注射后45min，用異氟烷麻醉，將模型鼠平放于Micro－PET掃描床上，掃描采集10min，圖像用OSEM 3D法進行重建。

2.4 傳統方法評價抗腫瘤藥藥效

每只模型鼠在18F－FLT MicroPET掃描前，均用游標卡尺測量瘤的長徑（a）和短徑（b），利用公式V＝1／2×a×b2計算瘤體積。

2.5 病理組織學實驗

通過對每次掃描的Micro PET數據進行分析，在對照組和給藥組瘤組織攝取18F－FLT有顯著性差異的時候，每一組模型鼠選擇一只，將其瘤組織剝離，置入4%中性甲醛固定，石蠟包埋，組織切片行HE染色。

2.6 統計學分析

所有實驗數據經統計學分析軟件SPSS 19.0進行分析，組間采用F檢驗，P＜0.05為有統計學差異，P＜0.01為有顯著差異。

3 結果與討論

3.1 18F－FLT MicroPET掃描結果

18F－FLT MicroPET掃描組織攝取情況列于表1。由表1可以看出，在給藥第2天，給藥組瘤 組 織 對18F－FLT 的 放 射 性 攝 取 平 均 為（3.87±0.61）%ID／g，比給藥前降低21.28%，到給藥第5天，瘤組織的放射性攝取降至最低，為（3.40±0.44）%ID／g，降幅為36.48%。而對照組第2天和第5天瘤組織的放射性攝取與給藥前相比，無明顯變化。用統計學軟件SPSS 19.0分析，給藥第2d，給藥組與對照組之間已有統計學差異（P＜0.05），F值為7.450；給藥第5d，給藥組與對照組之間有顯著性差異（P＜0.01），F值為17.961。

表 1 18F－FLT MicroPET掃描瘤組織攝取情況±s，n＝5）

表 1 18F－FLT MicroPET掃描瘤組織攝取情況±s，n＝5）

注：1）與對照組比P＜0.05；2）與對照組相比P＜0.01

放射性攝取／（%ID·g－1）時間／天0 2 5 9 14對照組 4.86±0.84 5.01±0.83 4.82±0.69 5.22±0.75 5.32±0.80給藥組 4.91±0.71 3.87±0.611） 3.53±0.352） 3.71±0.452） 3.83±0.532）

同一只給藥組模型鼠不同給藥時間相同層面的18F－FLT MicroPET掃描圖示于圖1，從圖1可以看出，隨著給藥時間的延長瘤組織18FFLT的濃聚程度不斷降低。

3.2 傳統方法評價抗腫瘤藥藥效結果

在各組模型鼠進行MicroPET掃描實驗的同時，每只荷瘤鼠的瘤組織都用游標卡尺測量其長、短徑，并利用公式V＝1／2×a×b2計算瘤體積數值，結果見列于表2。各組瘤體積的數據，用SPSS19.0軟件進行統計學分析，在給藥第9 d開始，給藥組和對照組才有顯著性差異（P＜0.01），F值為14.932。

表2 傳統方法測瘤體積數據（±s，n＝5）

表2 傳統方法測瘤體積數據（±s，n＝5）

注：1）與對照組相比P＜0.01

瘤體積／mm3給藥時間／d對照組 給藥組0 223.2±75.5 217.3±77.2 2 262.1±73.8 248.6±67.6 5 590.7±192.8 402.9±102.3 9 959.4±152.7 598.4±170.41）14 1 378.0±177.8 676.2±139.71）

3.3 病理組織學結果

從對照組和治療組各選一只小鼠進行病理組織學實驗：腫瘤HE染色后，低倍鏡下觀察，結果分別示于圖2和圖3。由圖2可以看出，對照組瘤細胞排列致密，細胞分裂增生旺盛，核異形明顯，細胞核染色較深，胞漿豐富；由圖3可見，給藥組瘤細胞排列松散，并呈現不同程度壞死。

圖2 對照組瘤組織病理切片

3.4 討 論

圖3 給藥組瘤組織病理切片

瘤徑測量的傳統療效評價方法結果顯示，在給藥第9d，給藥組和對照組瘤體積之間才有顯著性差異，而Micro PET掃描法在給藥第2d即觀察到，給藥組和對照組的瘤組織攝取18F－FLT的程度已出現明顯統計學差異。病理組織學實驗結果也顯示在給藥第2d，與對照組相比，給藥組瘤組織已呈現不同程度壞死。上述結果提示，當抗腫瘤藥物已開始有藥效作用時并不能立即通過實體瘤的體積的變化及時的反應出來，Micro PET掃描方法則不然，它是通過檢測對瘤組織的分子水平上的變化來檢測抗腫瘤藥物的藥效作用，因此可以更早、更精準地反應出抗腫瘤藥物的早期藥效。病理組織學實驗驗證也表明，在給順鉑藥第2d，瘤組織HE染色后鏡下觀察病理切片的結果已清晰顯示，與對照組相比，給藥組瘤組織已呈現不同程度壞死。

4 結 論

采用18F－FLT MicroPET 對順鉑療效進行了評價，與傳統抗腫瘤藥藥效評價方法進行相比，并結合病例組織學實驗進行結果驗證，發現A549肺癌模型在給藥后第2d用Micro PET即可觀察到腫瘤攝取明顯下降，比腫瘤體積檢測早7d。提示PET顯像可早期監測生物體內分子水平功能變化，與傳統方法如腫瘤體積測量相比，能更早、更精準地對抗腫瘤藥物的藥效進行評價。該方法有望在抗腫瘤、心血管、神經系統、葡萄糖代謝等藥物的藥效評價中得到進一步應用。

致謝：感謝江蘇省原子醫學研究所分子影像中心楊敏博士及其課題組成員在動物模型構建及數據分析方面提供的幫助；感謝江蘇省原子醫學研究所黃洪波在 Micro PET顯像方面提供的幫助；感謝江蘇省原子醫學研究所江原醫院病理科戴主任在病理切片實驗部分提供的幫助。

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