丙泊酚后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的長時程保護作用*

李 翠 王國林 王海云 羅猛強

腦缺血常伴有再灌注損傷，如何減輕這種損傷是臨床關注的重點之一，而臨床急性腦缺血發生的不可預測性，使得后處理具有更為廣闊的應用前景。腦缺血患者圍手術期間麻醉藥物的選擇是麻醉醫師需要慎重考慮的問題，近年來，丙泊酚由于起效快、清除迅速和不良反應少等優點被廣泛應用于臨床麻醉，其還能夠降低氧代謝率、抗氧化和抑制細胞凋亡從而減輕腦缺血再灌注損傷[1-2]。研究顯示，丙泊酚后處理對腦缺血再灌注損傷具有急性期保護作用[3]。這些研究大多限于損傷后8 d內，其是否具有長時程保護作用目前尚不清楚。本研究旨在觀察丙泊酚后處理是否對腦缺血再灌注損傷具有長時程保護作用，從而為臨床已發生或存在腦缺血潛在危險患者麻醉藥物的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性SD大鼠144只，10~12周齡，體質量250~280 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。丙泊酚購自意大利Astra Zeneca公司，脂質溶劑（丙泊酚脂質載體）類似物、10%脂肪乳注射液（C14~24）（intralipid）購自四川科倫藥業股份有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自 Sigma 公司。大腦中動脈阻塞（MCAO）線栓購自北京沙東生物技術有限公司，思路高TCI-Ⅰ型輸液泵購自北京思路高科技發展有限公司，Morris水迷宮及分析軟件EthoVision（荷蘭Noldus公司）。

1.2 動物模型的建立 參照Longa等[4]提出的可逆性MCAO線栓法加以改良制作局灶性腦缺血再灌注模型。10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉，右側股靜脈以小兒24號靜脈留置針插管，以備輸注液體，取頸正中切口，鈍性分離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external ca?rotid artery，ECA）及頸內動脈（internal carotid artery，ICA），并結扎右CCA、ECA近心端，根據大鼠個體不同選用不同球端直徑（0.24、0.26和0.28 mm）的栓線，于CCA分叉上方2 mm處將線栓球端置入ICA，沿ICA緩慢插入，向顱內深入直到感覺有輕微阻力即止，以CCA分叉處為起點，進線長度約為18~20 mm，此時大腦中動脈（MCA）起始處血流被阻斷，固定好線栓，縫合切口，線栓尾端留于皮膚外。缺血60 min后拔出線栓至CCA內進行再灌注。假手術組進線深度為10 mm。術中和術后室溫控制在25℃~28℃，用電燈泡照射大鼠保暖以保持直腸溫度為（37.0±0.5）℃，以動物蘇醒后出現左側以前肢為重的偏癱為造模成功。

1.3 實驗分組 將大鼠隨機分為4組，每組36只大鼠，分別為假手術組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、脂質溶劑對照組（I組）和丙泊酚后處理組（P組）。P組在再灌注即刻經股靜脈給予丙泊酚20 mg·kg-1·h-1泵注4 h，S組和IR組于該時間點泵注等體積的生理鹽水，I組泵注等體積的脂質溶劑，均持續4 h。

1.4 改良神經功能缺損程度（modified neurological severity score，mNSS）評分 每組各取 6 只大鼠在術后 1、3、7、14、21和28 d分別進行mNSS評分，包括運動、感覺、反射和平衡試驗，測試方法參考Chen等[5]的方法，得分越高提示神經功能損傷越重，0分為正常，18分為最高功能障礙。

1.5 腦梗死體積百分比測量 在術后1、7、14和28 d每個時間點每組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉后處死取腦，置于-20℃冰箱冷凍30 min后，以2 mm間距連續冠狀切成6片，棄去嗅球及小腦組織。放入1%TTC溶液中37℃溫箱避光孵育30 min，每隔15 min翻動腦片使均勻接觸到染色液，取出腦切片放至10%福爾馬林中固定，24 h后數碼相機拍照，輸入計算機，采用Imageproplus 6.0圖像處理軟件計算梗死面積（粉紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死組織），各腦片梗死面積之和乘以厚度（2 mm）即為腦梗死體積，以梗死體積占全腦體積得百分比作為腦梗死體積百分比，其中為代償腦缺血后水腫效應，腦梗死面積矯正計算方法如下：矯正后梗死面積=測量的梗死面積×{1-[（同側半球面積-對側半球面積）/對側半球面積]}[6]。

1.6 Morris水迷宮測試 每組各取6只大鼠于術后8和22 d開始進行兩周期的Morris水迷宮測試，檢測大鼠空間學習記憶能力。參照Vorhees等[7]的方法，進行每周期歷時5 d的定位航行實驗，記錄大鼠逃避潛伏期（escape latency，EL；即從大鼠入水到找到水下隱蔽平臺并立于其上所需時間)，用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的能力。

1.7 統計學方法 采 用SPSS 17.0統計軟件進行分析，所有數據均以±s表示，mNSS評分、梗死體積百分比及定位航行實驗數據均用單因素方差分析進行檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mNSS評分 S組無神經功能缺損，各時間點均為0分。與S組相比，IR組和I組在缺血后多時間點的mNSS評分差異均有統計學意義（均P<0.01），P組評分隨缺血時間延長逐漸降低，在缺血后28 d與S組比較差異無統計學意義；IR組與I組比較差異無統計學意義（P>0.05）；P組大鼠缺血3 d后的mNSS評分與IR組比較有明顯的降低（P<0.05或P<0.01），見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分比較 （n=6，分±s）

表1 各組大鼠mNSS評分比較 （n=6，分±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2~4同

組別S組（1）IR組（2）I組（3）P 組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）1 d 0 10.50±1.05 10.33±1.03 9.17±1.17 172.20**27.369**26.926**23.903**0.443 3.467 3.024 3 d 0 9.17±0.98 8.67±1.03 6.83±1.33 113.10**23.075**21.817**17.187**1.258 5.888**2.919 7 d 0 7.83±0.75 7.50±1.05 6.00±1.26 97.55**21.269**20.373**16.298**0.896 4.971*4.074*14 d 0 4.83±0.98 5.17±0.75 3.33±1.03 51.45**14.720**15.757**10.149**1.036 4.571*5.608**21 d 0 2.83±0.75 2.50±0.55 1.00±0.63 33.16**12.342**10.903**4.361*1.439 7.981**6.542**28 d 0 2.00±0.63 1.50±0.55 0.50±0.55 20.00**9.789**7.341**2.447 2.447 7.341**4.894*

2.2 腦梗死體積百分比 假手術組大鼠均未見明顯梗死灶，IR組、I組及P組均出現大小不一的梗死灶；IR組與I組腦梗死體積百分比差異無統計學意義（P>0.05）；P組的腦梗死體積百分比較IR組、I組小（P<0.05或P<0.01），P組在28 d與S組比較差異無統計學意義，見圖1、表2。

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比 （n=6，%±s）

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比 （n=6，%±s）

組別S組（1）IR組（2）I組（3）P 組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）1 d 0 25.80±0.86 26.23±1.85 17.38±0.75 776.64**58.149**59.118**39.172**0.969 18.977**19.946**7 d 0 16.64±2.57 16.37±1.49 12.96±0.68 159.29**26.752**26.318**20.836**0.434 5.916**5.482**14 d 0 6.60±1.34 7.04±0.82 3.95±1.15 66.19**16.607**17.714**9.939**1.107 6.668**7.775**28 d 0 2.73±0.94 2.68±0.95 1.23±0.79 16.92**8.615**8.457**3.881 0.158 4.733*4.576*

2.3 Morris水迷宮測試 定位航行實驗中各組大鼠兩周期的EL見表3、4。S組EL較IR及I組縮短（P<0.01），在8~11 d及22 d，P組較 S組 EL延長（P<0.05和P<0.01），在12 d及23~26 d，P組與 S組比較差異無統計學意義（P>0.05）；IR組與I組之間EL差異均無統計學意義（P>0.05）；P組除8和22 d外，EL均較IR組縮短，差異均有統計學意義（均P<0.05）。

表 3 各組大鼠8~12 d的EL比較 （n=6，s±s）

表 3 各組大鼠8~12 d的EL比較 （n=6，s±s）

組別S組（1）IR組（2）I組（3）P 組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）8 d 75.44±12.68 114.62±10.10 108.34±9.32 100.48±13.01 13.66**8.426**7.075**5.385**1.350 3.041 1.690 9 d 50.70±9.94 95.23±18.45 98.72±13.46 72.92±9.94 16.57**8.135**8.772**4.059*0.638 4.076*4.713*10 d 29.69±9.01 79.78±14.01 67.83±11.37 49.70±8.72 23.78**11.168**8.504**4.462*2.664 6.707**4.042**11 d 18.93±6.52 51.58±13.21 52.42±7.33 35.25±9.49 16.72**8.421**8.637**4.209*0.217 4.211*4.428*12 d 14.90±5.62 35.60±7.58 33.42±6.32 20.04±10.58 10.16**6.534**5.846**1.622 0.688 4.912*4.223*

表 4 各組大鼠22~26 d的EL比較 （n=6，s，±s）

表 4 各組大鼠22~26 d的EL比較 （n=6，s，±s）

組別S組（1）IR組（2）I組（3）P組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）22 d 17.57±4.37 33.59±5.70 35.32±6.12 29.48±8.92 9.10**6.02**6.68**4.48*0.65 1.55 2.20 23 d 12.56±2.17 29.47±6.00 27.35±5.32 20.13±8.00 10.61**7.18**6.28**3.22 0.90 3.97*3.07 24 d 10.40±1.94 28.15±6.18 28.76±5.33 18.79±6.73 4.60*8.09**8.36**3.82 0.28 4.26*4.54*25 d 9.44±1.53 26.21±7.30 24.87±4.73 15.35±3.96 16.32**8.488**7.810**3.497 0.678 4.990*4.312*26 d 8.81±1.10 22.86±5.91 20.19±4.33 13.40±3.74 14.25**8.28**7.30**3.30 0.98 4.99*4.00*

3 討論

參照Longa法制作的大鼠MCAO局灶性腦缺血再灌注模型是研究腦缺血的經典模型。在局灶性腦缺血再灌注損傷中，梗死部位多反映在大腦皮質及基底節區，缺血后多伴隨功能性的改變。因此本研究通過形態學和功能學相結合的方法評價腦損傷狀況，mNSS評分和梗死體積測量是評價腦缺血再灌注損傷的金指標。海馬區神經元對缺血缺氧耐受能力較差，腦缺血會直接或間接引起海馬區神經元的變性壞死，不同程度影響個體的學習及記憶功能[7]。本研究應用Morris水迷宮對大鼠腦缺血損傷后空間學習記憶能力進行客觀評價，從另一方面反映大鼠神經功能缺損情況。

藥物后處理通過藥物激發或模擬機體內源性物質（如腺苷、緩激肽等），從而發揮腦保護作用，以藥物替代缺血刺激，較缺血后處理在臨床上更具有應用價值。靜脈麻醉藥丙泊酚由于能降低腦氧代謝率及顱內壓等腦生理藥理學特性，被認為是神經外科手術較為理想的麻醉用藥。筆者前期研究結果顯示于再灌注血流再通即刻給予丙泊酚10和20 mg·kg-1·h-1后處理30 min對腦缺血再灌注損傷具有急性期保護作用，能夠減少腦梗死體積和細胞凋亡，改善神經缺損評分，20 mg·kg-1·h-1組效果更明顯[3]，但其是否具有長時程保護作用的研究尚少見。臨床上應用的丙泊酚多以甘油、卵磷脂、大豆油等脂質成份作為賦形劑，主要成分為多不飽和脂肪酸，具有促炎癥反應和免疫抑制效應[8]。

本研究結果顯示，丙泊酚脂質溶劑成分并不參與調控或介導丙泊酚后處理的長時程腦保護作用，再灌注即刻給予丙泊酚20 mg·kg-1·h-1后處理4 h，從總體上能夠明顯改善mNSS評分、減小大鼠腦組織梗死體積及改善缺血大鼠的學習記憶水平，從形態和功能兩方面表明丙泊酚后處理具有長時程的腦保護作用，且其保護時間窗至少長達缺血后28 d，且這種腦保護作用可能最終通過縮小腦梗死體積及改善神經功能來實現。

綜上所述，丙泊酚缺血后處理有一定的長時程腦保護作用，且這種作用可維持至28 d，與脂質溶劑成分無關。

[1]馬婕,董志,李勤耕,等.丙泊酚對實驗性腦出血大鼠的腦保護作用[J].藥學學報,2009,44(4):344-349.

[2]Chen L,Xue Z,Jiang H.Effect of propofol on pathologic time-course and apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Acta An?aesthesiol Scand,2008,52(3):413-419.

[3]Wang HY,Wang GL,Yu YH,et al.The role of phosphoinositide-3-ki?nase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against fo?cal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Brain Res,2009,1297:177-184.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cere?bral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]Chen J,Li Y,Wang L,et al.Therapeutic benefit of intravenous ad?ministration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32(4):1005-1011.

[6]Xing B,Chen H,Zhang M,et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat[J].Stroke,2008,39(8):2362-2369.

[7]Vorhees CV,Williams MT.Morris water maze:procedures for assess?ing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Pro?toc,2006,1(2):848-858.

[8]Das UN.Perinatal supplementation of long-chain polyunsaturated fatty acids,immune response and adult diseases[J].Med Sci Monit,2004,10(5):HY19-25.