CIK細胞治療乳腺癌的臨床療效評估

解燕華，左 鐵，孟明耀，劉運洪，鄭建平，金醒昉，侯宗柳

（昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051）

多種細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokines induced killers,CIK） 是一類由多種細胞因子誘導的具有T細胞的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點。1991年由斯坦福大學的Schmidt-Wolf等報道后，現成為免疫治療多種惡性腫瘤應用最為廣泛的細胞治療之一[1]。CIK細胞應用于臨床需要足夠數量的細胞及良好的活性和細胞毒作用。但CIK細胞對乳腺癌的臨床治療效果有待于進行系統(tǒng)地臨床觀察。本研究對細胞增殖規(guī)律、細胞表型和細胞毒作用進行研究，同時進行近期臨床療效、免疫反應及不良反應的觀察。

材料和方法

一、研究對象：35例乳腺癌患者進行CIK細胞治療（最大年齡82歲，最小31歲，平均年齡56.57歲）。入組標準，組織學或細胞學確診為乳腺癌患者，接受過乳腺癌的規(guī)范化治療包括手術、化療，末次治療至開始接受CIK治療的間隔時間為4周；無法進行手術、放療、化療的中晚期患者，患者預期生存＞3個月；PS評分≧60分，無嚴重的病毒、細菌感染。本研究獲本單位倫理學委員會的批準，所有患者或由其法定代理人簽署了知情同意書，同意進行此免疫治療。排除標準，正在接受放療、化療或其他全身抗腫瘤治療者；同時存在其他惡性腫瘤及傳染性疾病者；大手術傷口未完全愈合者；懷孕期或哺乳期婦女；存在違反本試驗的體檢或實驗室異常者；對生物制品過無敏反應者。

二、材料：RPMI1640購自美國Gibco公司。抗人CD3單克隆抗體（Anti-CD3 mAb） 購自北京市晶美基因谷科技有限公司。IL-2購自江蘇金絲利有限公司。IFN－γ購自上海克隆生物高新技術有限公司。流式試劑CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP，CD3 FITC/CD56PE/CD45PerCP購自美國BD公司。胎牛血清購自HyClone公司。淋巴細胞分離液購自天津瑞灝生物制品科技有限責任公司。流式細胞儀為美國BD Calibur FACSTM。酶標分光光度計為美國Bio-Rad Model-680。二氧化碳孵箱為美國Forma SeriesⅡModel 3111。BEL-7404人肝癌細胞株由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供。

三、方法：1.CIK細胞培養(yǎng) 淋巴細胞提取，采用Ficoll離心分離，將分離的細胞密度調至1×109/L。分別懸于傳統(tǒng)RPM I1640培養(yǎng)基 （RPM I1640＋100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素） 和改良RPMI1640培養(yǎng)基（RPM I1640，100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素，HEPES 20mmol/L，丙酮酸鈉8mmol/L，β－巰基乙醇20μmol/L，適量的核苷酸和脫氧核苷酸），加入IFN－γ 1000U/ml，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h后，再加入抗人CD3mAb，50ng/ml，IL-21000U/ml 37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)9～12d行體外細胞表型和細胞增殖檢測。

2.細胞增值數量和表型測定 于培養(yǎng)當天及9～12d用臺盼藍拒染法計數細胞，計算細胞擴增數量，同時用流式細胞術分析細胞CD3+CD56+。方法參照文獻[2]。

3.CIK細胞體外殺傷活性分析 取培養(yǎng)12d患者的CIK細胞作為效應細胞，靶細胞為BEL-7404人肝癌細胞，按效靶比16∶1、8∶1、4∶1比例加入96孔培養(yǎng)板中，另設單獨靶細胞組和單獨效應細胞組作為對照，在37℃，5%CO2培養(yǎng)48h后，棄未貼壁的死細胞，用1640培養(yǎng)液洗3次，加入5mg/ml MTT 50μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，然后每孔加入100μl DMSO溫育至結晶溶解，在570nm波長處檢測吸光值A，計算細胞毒活性[3,4]。

4.免疫治療計劃 每位患者在接受其他標準治療后4周，在完善治療前基線評估后，靜脈回輸CIK細胞，每次近似于2×109個，總體100ml，每3～5次為一療程。根據患者病情，每個患者進行3～4個療程治療。在完成上述規(guī)定治療后，所有患者在接受治療后即開始進入隨訪期。

5.療效評價與觀察指標 主要終點評價指標為無腫瘤進展時間，次要終點評價指標為近期療效和不良事件。無腫瘤進展時間定義為：接受免疫治療起到腫瘤進展時間。臨床療效評價：若有可評價病灶的患者的臨床療效評定，按照衛(wèi)生部頒布的實體瘤客觀療效評定標準進行。完全緩解(CR)：瘤體完全消失持續(xù)至少4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤最大直徑減少50%以上，持續(xù)至少4周；病情穩(wěn)定(SD)：腫瘤增大或縮小均不超過25%，無新病灶；病情進展(PD)：腫瘤增長大于25%或出現新的病灶。完全緩解+部分緩解為近期有效率，完全緩解+部分緩解+病情穩(wěn)定為疾病控制率。若無可評價病灶的患者影像學檢查發(fā)現疾病復發(fā)或轉移則為病情進展(PD)。接受治療后第4周、第8周評價近期臨床療效，復查胸部CT，評估臨床癥狀，血常規(guī)、血生化常規(guī)等；如懷疑有腫瘤轉移，加做相關檢查。

6.免疫學評價 接受治療后2周末，評價12例患者治療前后外周血中CD3+，CD4+，CD8+，CD56+的變化。

7.不良事件 依據美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應標準，將各種不良事件分為0～Ⅳ度，Ⅰ度+Ⅱ度+Ⅲ度+Ⅳ度為毒性反應發(fā)生率。

8.隨訪 所有患者在療效評價之后每3個月隨訪1次，行相關檢查。如懷疑有腫瘤轉移，加做相關檢查。病情進展的患者接受其他治療方案，仍然接受隨訪。截止時間為2010年3月31日。

9.統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS13.0軟件包處理，均數±標準差（SD） 表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著意義。

結 果

一、細胞增殖結果：在CIK細胞分離培養(yǎng)3～6d細胞增值較慢，但是當細胞在培養(yǎng)9d以后細胞增殖明顯，是一個快速增殖的過程，在12d以后達到了442.66±85.27。

二、細胞表型：CIK細胞在培養(yǎng)12d以后，CD3+CD56+達到了33%以上，在15～18d之后達到了50%左右。說明培養(yǎng)的CIK細胞能得到純度很高的細胞。

三、細胞毒活性：效靶比為4∶1、8∶1、16∶1時，細胞毒活性分別為37.13±11.44、56.91±10.43和77.06±11.62，其中效靶比為16∶1時細胞毒活性最大。

四、臨床療效評價：35例患者隨訪時間為3～15個月，患者普遍在輸注CIK細胞后精神癥狀好，同時增強食欲、改善睡眠、增強體力，增加體重。35例患者中，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期11例，失訪3例。所有的患者均為手術后實行CIK治療，20例治療了2個療程以上。最長隨訪時間為31月，中期隨訪時間為15個月。近期療效評價中，完全緩解24例，部分緩解6例，病情穩(wěn)定1例，近期有效率為85.71%，疾病控制率為88.57%，無腫瘤進展時間為2～31個月，中位無腫瘤進展時間為15個月。

五、免疫學療效評價：治療結束后2周末，所有患者CD3+，CD4+，CD8+均較治療之前有明顯升高（P≤0.001），提示該療法提高了患者體內的CD3+CD4+，CD8+基礎水平，可誘導患者產生特異性的抗腫瘤免疫反應，見附表。

附表 CIK治療乳腺癌前后的免疫學療效評價

六、不良事件分析：在接受CIK細胞過繼免疫治療的35例患者中，依據美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應標準，并未出現Ⅲ度+Ⅳ度的嚴重不良反應。1例出現一過性發(fā)熱反應。

討 論

免疫細胞過繼療法已成為放、化療后，對腫瘤患者進行輔助治療的重要手段之一，對于促進患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變，以及骨髓凈化都具有良好的效果。CIK細胞是一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞，體外實驗表明，其具有較好的擴增性能和很強的腫瘤殺傷活性[5,6]，而對于自身組織則沒有細胞毒作用，但將其應用于臨床，必須有足夠的數量和較強的細胞毒活性。我們培養(yǎng)中采用最常用的細胞因子組合：IFN-γ＋CD3＋IL-2刺激誘導CIK細胞增殖，結果表明，細胞純度在12達到34.44%左右，與文獻報道相符。細胞毒活性，CIK細胞培養(yǎng)13d后，對BEL-7404細胞殺瘤率平均是77.06±11.62，達到了較強的細胞毒活性。

本研究中對35例乳腺癌患者治療后臨床療效主要表現在以下幾個方面：一是大多數病例經過手術、化療等治療的同時或之后，輸注CIK細胞治療可以在不損傷機體免疫系統(tǒng)結構和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細胞，進一步達到清除體內殘留癌細胞的目的；二是該療法提高了患者體內的CD3+CD4+基礎水平，可誘導患者產生特異性的抗腫瘤免疫反應，大大提高患者自身免疫力。三是一定程度上減輕病人的痛苦，提高生活質量，同時增強食欲、改善睡眠、增強體力，增加體重。

CIK細胞療法既可應用于乳腺癌的治療，對于手術切除、化療等治療的同時或治療后的病人療效更佳。并且還能調節(jié)和增強全身免疫機能，在體內長期發(fā)揮抗腫瘤的活性，除可以消滅體內的腫瘤細胞外，還可防止腫瘤復發(fā)及轉移。更重要的是，CIK細胞療法對人體正常細胞、機體免疫系統(tǒng)沒有任何傷害，是一種安全可靠、無副作用的腫瘤治療方法。此外，CIK細胞療法在內科治療的基礎上，對無法進行手術、晚期和高齡患者進行聯合治療，從而達到延長患者生命的目的。

［1］SCHMIDT-WOLF GD,NEGRIN RS,SCHMIDT-WOLF IG.Actived T cells and cytokine-induced CD3+CD56+killer cells[J].Annals ofHematology,1997,74:51-56.

［2］潘春華,羅榮城.CIK細胞的表型分析及生物學活性研究[J].解放軍醫(yī)學雜志,2003,28(11):1030-1032.

［3］任歡,徐紅薇.CIK細胞的體外增殖及殺瘤活性的實驗研究[J].中國免疫學雜志,1998,14(6):406-408.

［4］李淑艷,楊秀珍.MTT法檢測CIK細胞的體外殺瘤活性[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2003,24(1):3-5.

［5］SCHMIDT-WOLF IG,LEFTEROVA P,JOHNSTON V,et al.Propagation of large numbers of T cells with natural killercell markers[J].Br J Haematol,1994,87(3):453.

［6］FINKE S,TROJANECK B,LEFIEROVA P,et al.Increase of proliferation rate and enhancement of antitumor cytoxicity of expanded human CD3+CD56+immunologic effector cells by receptor-mediated transfection with the interleukin-7 gene[J].Gene Ther,1998,5(1):31.