榅桲提取物對(duì)抗血栓作用的實(shí)驗(yàn)觀察

烏蘭巴依爾， 楊永新， 王雪飛， 周文婷， 阿布來提·阿布力孜， 依巴代提·吐乎提， 艾尼瓦爾·吾買爾*

(1.新疆巴州衛(wèi)生學(xué)校，新疆 庫爾勒841000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆烏魯木齊830054)

榅桲(Cydonia Oblanga Miller，COM)在我國有著悠久歷史，是薔薇科(Rsaceae)榲桲屬(Cydonia)的果樹［1］，是維吾爾醫(yī)應(yīng)用歷史悠久的常用藥材之一。維文名為比葉(Biye)，別名為蠻檀，英文名Quince。根據(jù)《新疆維吾爾藥志》及《維吾爾常用藥材學(xué)》記載，維吾爾族用榲桲補(bǔ)血、補(bǔ)腦、止咳、降血壓、降脂;它具有治胃病、肝病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)等功效［2-4］。現(xiàn)代研究表明，榲桲中化學(xué)成分極為豐富，成熟果實(shí)含有果糖、肉質(zhì)、原果膠、有機(jī)酸、氨基酸等;果肉含肉豆蔻酸、異油酸甘油脂、揮發(fā)油、黃酮等;果皮含庚基乙基醚和壬基乙基醚等［5］;種子主要含黏質(zhì)、苦杏仁苷、脂肪油等;葉子含有生物堿、葡萄糖苷、鞣質(zhì)、黏質(zhì)、酮糖、醛糖、脂質(zhì)、維生素C、氰苷等［6-8］。國外廣泛用于食品和藥品中［9］，目前在國內(nèi)榲桲用于醫(yī)學(xué)、食品等方面沒被開發(fā)，榅桲應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)及活性缺乏深入研究［8］。本課題以開發(fā)和研究新疆民族藥作為出發(fā)點(diǎn)，充分利用榲桲在新疆的地產(chǎn)資源和栽培資源［4］，為其提供口服型抗栓藥具有一定意義。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)榅桲葉進(jìn)行水提取，從抗凝血、纖溶、抗動(dòng)脈血栓等方面探討榅桲提取物的作用及機(jī)制，為其進(jìn)一步研究有效部位和作用靶點(diǎn)提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 儀器、材料、動(dòng)物

1.1 藥品與試劑 榅桲提取物(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室提供)，阿司匹林(新疆華康藥業(yè)有限公司，批號(hào)020511)，銀杏葉片(天津天士力制藥有限公司，批號(hào)259)，烏拉坦(上海三浦化工有限公司，批號(hào)080409)，凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)121046)，凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)102108)活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)112098)。

1.2 儀器 RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DK-S24數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，SK8210HP超聲儀(上海科導(dǎo)儀器廠)，BL1500電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KH-120M型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠)，定時(shí)鐘(上海第二鐘廠)，秒表(上海秒表廠)，分析天平(梅特勒-托利多儀器廠)。

1.3 動(dòng)物 ICR小白鼠，雄性，60只，體質(zhì)量18～22 g，清潔級(jí);均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(新)2003-001。

Wistar大鼠，雄性，42 只，體質(zhì)量 300 ～350 g，清潔級(jí);均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(新)2003-0001。

2 試驗(yàn)方法

2.1 榅桲提取物對(duì)小鼠優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)的影響［10-12］取小白鼠60只，體質(zhì)量22～28 g，雄性，隨機(jī)分為6組，分別灌胃給予生理鹽水對(duì)照組，榅桲提取物小、中、大劑量(20、40、80 mg/kg)組，陽性對(duì)照組阿司匹林(5 mg/kg)和銀杏葉片(20 mg/kg)連續(xù)給藥14 d，在末次給藥1 h，眼眶靜脈采血1 mL，試管中加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝，嚴(yán)格控制抗凝劑與血的比例為1∶9。3000 r/min離心10 min，取血漿0.25 mL，加4.5 mL蒸餾水，再加入1%乙酸0.05 mL 使 pH為9，充分混合后，將混合液置于4℃的冰箱中10 min后，3000 r/min離心5 min，將優(yōu)球蛋白沉淀分出。傾去上清液，將試管倒置于濾紙上吸取多余的液體。加硼酸緩沖液(pH=9.0)0.25 mL于試管中，用細(xì)玻璃棒小心攪拌溶解約1 min，將試管放入37℃水浴中2 min后，加入0.025%氯化鈣0.25 mL，使其凝固。每隔10 min觀察1次，直至凝塊完全溶解為止，記錄其凝塊完全溶解所需的時(shí)間，即為優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間。結(jié)果見表1。

表1 榅桲水提取物對(duì)小鼠優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的影響(± s，n=10)

表1 榅桲水提取物對(duì)小鼠優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的影響(± s，n=10)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.01;小劑量組與阿司匹林組比較，#P＜0.05;大劑量組與銀杏葉片組比較，▲P ＜0.05。

/min生理鹽水組 10 —257.8 ±52.161銀杏葉片組 10 20 156.6 ±25.131*阿司匹林組 10 5 112.3 ±57.669*小劑量組 10 20 183.0 ±49.315*#中劑量組 10 40 157.5 ±11.167*大劑量組 10 80 111.7 ±37.901＊▲組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(mg/kg)優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間

觀察方法:藥物對(duì)大鼠血栓形成抑制率。結(jié)果見表2。

表2 榅桲提取物對(duì)大鼠動(dòng)—靜脈旁路血栓形成的影響(± s，n=7)

表2 榅桲提取物對(duì)大鼠動(dòng)—靜脈旁路血栓形成的影響(± s，n=7)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05;大劑量組與阿司匹林組比較，#P ＜0.05;大劑量組與銀杏葉片組比較，▲P ＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(mg/kg)血栓/mg抑制率/%生理鹽水組 7 — 15.17±2.250—銀杏葉片組 7 20 8.014 ±0.807* 47.4阿司匹林組 7 5 9.317 ±3.743* 38.8小劑量組 7 20 9.971 ±2.445* 34.2中劑量組 7 40 6.971 ±1.903* 53.9大劑量組 7 80 3.610 ±0.453*#▲ 76.3#▲

2.3 榅桲提取物對(duì)大鼠凝血功能的影響 取Wistar大鼠，雄性，42只，體質(zhì)量300～350 g，動(dòng)物分組，給藥，麻醉及手術(shù)方法同2.2項(xiàng)。在無菌條件下，造模20 min后，腹主動(dòng)脈采血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為9∶1，3500 r/min離心15 min，取血漿。按試劑盒說明測(cè)定 TT、PT和APTT。結(jié)果見表3。

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與處理 觀察指標(biāo)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)%表示;實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，各組之間比較采用t檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。

3 結(jié)果

3.1 榅桲提取物對(duì)小鼠優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)的影響結(jié)果如表1所示，與生理鹽水對(duì)照組相比，榅桲提取物小、中、大劑量(20、40、80 mg/kg)組顯著縮短小鼠優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間(P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小劑量組與阿司匹林組比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;大劑量組與銀杏葉片組比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

3.2 榅桲提取物對(duì)大鼠動(dòng)—靜脈旁路血栓形成的影響結(jié)果如表2所示，與生理鹽水對(duì)照組相比，榅桲提取物小、中、大劑量(20、40、80 mg/kg)組均明顯減輕血栓濕重(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大劑量組與阿司匹林組相比(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與銀杏葉片組相比(P ＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。榅桲提取物小、中、大劑量組對(duì)大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓抑制率分別為 34.2%，53.9%和76.3%(P ＜0.05)。

3.3 榅桲提取物對(duì)大鼠凝血功能的影響 結(jié)果如表3所示，與生理鹽水對(duì)照組相比，榅桲提取物小劑量組(20 mg/kg)明顯延長(zhǎng)PT(P＜0.05);榅桲提取物中、大劑量(40、80 mg/kg)組顯著延長(zhǎng) TT、PT、APTT(P ＜0.01)。榅桲提取物大劑量組與阿司匹林組和銀杏葉片組比較(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

4 討論

在前一期的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)榅桲提取物明顯延長(zhǎng)出血時(shí)間和凝血時(shí)間，具有明顯的纖溶和抗肺栓塞作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)榅桲提取物的抗血栓作用及機(jī)制進(jìn)行了藥理學(xué)基礎(chǔ)研究。

在小鼠ELT實(shí)驗(yàn)中，隨著劑量的增加，榅桲提取物對(duì)小鼠ELT的縮短作用逐漸增強(qiáng)。ELT反映纖溶活性，與激活纖溶活性物質(zhì)有關(guān)［10-11］。榅桲提取物激活了纖溶活性物質(zhì)，促纖溶活性而促進(jìn)了優(yōu)球蛋白的溶解性。

表3 榅桲提取物對(duì)大鼠凝血功能的影響(± s，n=7)

表3 榅桲提取物對(duì)大鼠凝血功能的影響(± s，n=7)

注:與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

TT/s PT/s APTT/s生理鹽水組組別 動(dòng)物數(shù)/只 劑量/(mg/kg)13.9 ±5.792 11.3 ±2.596 23.6 ±1.812銀杏葉片組 7 20 31.4±6.884＊＊ 24.1±13.260* 43.1±15.102＊＊阿司匹林組 7 5 30.5±11.934＊＊ 32.4±11.562＊＊ 34.2±8.204＊＊小劑量組 7 20 17.2 ±9.928 19.4 ±9.676* 27.5 ±11.271中劑量組 7 40 22.9±2.512＊＊ 24.7 ±10.89＊＊ 39.46.±13.754＊＊大劑量組 7 80 25.2±8.438＊＊ 28.0±9.797＊＊ 42.43±10.1237－＊＊

在大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成實(shí)驗(yàn)中，隨著劑量的增加，榅桲提取物對(duì)動(dòng)-靜脈旁路血栓逐漸降低血栓濕重，動(dòng)脈血栓形成率也降低，具有量效關(guān)系。動(dòng)-靜脈旁路血栓模型中形成的血栓，類似于動(dòng)脈中血栓［13，15］，反映整體動(dòng)脈血流中血小板的黏附、聚集功能，當(dāng)血小板聚集功能受到抑制時(shí)，血栓的重量就減輕［16-19］。榅桲提取物明顯降低大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓濕重的作用與抑制血小板聚集而抗血栓形成有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中榅桲提取物明顯延長(zhǎng)了TT、PT、APTT。TT延長(zhǎng)反映纖維蛋白原降解及其降解產(chǎn)物增加，PT延長(zhǎng)反映凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的缺乏，APTT延長(zhǎng)反映凝血因子Ⅸ缺乏［10-11］，榅桲提取物的作用與凝血因子缺乏和纖維蛋白原降解產(chǎn)物增加有關(guān)，從而抑制凝血功能。

綜上所述，榅桲提取物具有明顯的抑制動(dòng)脈血栓形成，抗凝血和纖溶作用。在口服型抗血栓藥物方面有一定的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值。

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