高效液相色譜法同時測定豨薟草中豨薟苷和奇壬醇

許鳳清， 劉金旗， 王舉濤， 黃金萍， 張 娟

(安徽中醫學院藥學院/安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽合肥230038)

豨薟草為常用中藥，始載于唐代《新修本草》，《中國藥典》2010年版收載菊科植物豨薟Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨薟Siegesbeckia pubescens Makino.和毛梗豨薟Siegesbeckia glabrescens Makino.的地上干燥部分，具有祛風濕，利筋骨的功能。臨床上主要用于風濕痹痛、腰膝酸軟、四肢麻痹、半身不遂、風疹濕瘡等癥。近年來研究發現豨薟草在心血管系統、抗炎、降壓擴張血管、微循環系統、免疫系統以及抗早孕方面均顯示良好的活性［1-7］。其主要成分為二萜類化合物，包括豨薟苷、奇壬醇、豨薟苷元、豨薟萜內酯等［8］，總萜類成分定量測定采用紫外分光光度法［9］。目前，奇壬醇作為其定量檢測標準［10］，本實驗通過HPLC法檢測豨薟草中另一主要活性物質豨薟苷來完善豨薟草的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津LC-20AT);SPD-20A紫外檢測器;N2010色譜工作站;AS3120型超聲清洗器(Autoscience公司);CP2115D電子天平(Sartorius公司)。

1.2 試藥 豨薟苷對照品(由安徽中醫學院藥學院天然藥化教研室［11］自制);奇壬醇對照品(中國藥品生物制品檢定所111726-200601);乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。豨薟草分別收集和采購于安徽省各不同中藥材產地，由安徽中醫學院中藥資源教研室劉守金教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液(24∶6∶70);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:215 nm;進樣量:20 μL。該色譜條件下豨薟苷、奇壬醇達到基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)和亳州飲片廠豨薟草(B)HLPC圖譜

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取豨薟苷、奇壬醇對照品1.68 mg、2.66 mg，分別置于 10 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取5.0 mL對照品溶液，置10 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液。豨薟苷質量濃度為84 μg/mL，奇壬醇質量濃度為 133 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備［12］精密稱取豨薟草粉末1 g，置索氏提取器，加沸程60～90℃的石油醚浸泡過夜，連續回流5 h，冷卻，取出濾紙筒，揮盡石油醚，轉移到100 mL的燒瓶，精密加入甲醇50 mL，稱質量，加熱回流2 h，放置至室溫，再次稱質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，續濾液作為供試品試液。

2.4 線性關系考察 精密移取豨薟苷和奇壬醇混合對照品貯備液 1、2、4、8、10、20 μL，按 2.1 項色譜條件進行測定，記錄峰面積，以對照品進樣質量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。得豨薟苷回歸方程為 Y=843867X －34778，r=0.9998，在 0.084 ～1.68 μg 范圍內呈良好的線性關系;奇壬醇回歸方程為 Y=1615648X+8592，r=0.9999，在 0.133 ～2.66 μg 范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 按2.3項下方法制備的供試品溶液(亳州飲片廠)重復進樣6次，記錄峰面積，測定豨薟苷、奇壬醇，RSD值分別為1.20%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗考察 取豨薟草樣品(亳州飲片廠)供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進樣，按上述條件測定，記錄峰面積，測定豨薟苷、奇壬醇，RSD分別為 1.52%、1.64%，說明樣品在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗 取豨薟草樣品(亳州飲片廠)，精密稱定6份，置索氏提取器中，按照2.3項下操作，測定豨薟苷、奇壬醇，RSD值分別為1.82%、2.03%，表明方法的重復性較好。

2.8 加樣回收試驗 取已知豨薟苷和奇壬醇質量分數(分別為 0.357%、0.053%)的亳州飲片廠豨薟草 0.5 g，精密稱定。按照2.3項下方法脫脂后，每3份為1組分別加入80%、100%、120%量的豨薟苷和奇壬醇對照品后，按2.3項下方法制備供試品溶液，按上述的色譜條件測定，記錄峰面積，計算豨薟苷、奇壬醇的平均回收率和 RSD分別為98.44%，2.27%和 100.58%，2.42%。結果見表1。

表1 豨薟苷、奇壬醇加樣回收試驗結果 (n=9)

2.9 樣品測定 按2.3項下方法制備樣品溶液，分別進樣檢測，并記錄豨薟苷和奇壬醇峰面積，經計算，結果見表2。

3 討論

3.1 在樣品處理的過程中，程志宏等［12］曾采用石油醚脫脂法處理豨薟草葉片中大量葉綠素，取得較好的效果;豨薟苷分離工作中發現豨薟草中富含大量的鹽，且豨薟苷在甲醇中的溶解度不佳，本實驗采用的樣品處理方法達到HPLC樣品處理要求。同時考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸鹽，乙腈-磷酸鹽溶液等流動相，最終確定乙腈-甲醇-0.05 mol/L KH2PO4(24∶6 ∶70)，體積流量為1.0 mL/min，分離效果良好，豨薟苷、奇壬醇分別在17 min、24 min左右出峰，分析快速準確，重復性好，回收率高，是測定豨薟草中有效成分的理想方法。

表2 豨薟草中豨薟苷、奇壬醇的測定結果 (n=2)

3.2 通過實驗發現，安徽省各產地豨薟草中豨薟苷的質量分數在0.017% ～0.379%之間，平均質量分數為0.18%，奇壬醇的質量分數在0.009% ～0.141%之間，平均質量分數為0.067%，不同種類豨薟草中豨薟苷、奇壬醇質量分數變化并無規律;不同產地豨薟草中二者質量分數相差也較大且不成比例關系。

3.3 豨薟苷是豨薟草中有效成分之一，質量分數較高，以葡萄糖苷的形式存在于豨薟草植物體中，通過文獻研究發現豨薟苷僅為豨薟草所獨有，專屬性強。因此，建議在豨薟草的質量標準中增加豨薟苷并結合奇壬醇共同控制豨薟草的質量。

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