小干擾垂體特異性轉錄因子-1對大鼠垂體生長激素腫瘤細胞侵襲行為的影響

范月超，張 慧，李錦曉，李中林，縱振坤，陳 晨，馮 力，苗發安，謝滿意

徐州醫學院附屬醫院神經外二科，江蘇 徐州 221002

垂體生長激素腺瘤是內分泌癥狀活躍的一種侵襲性垂體瘤，生長激素（CH）過度分泌，被視為惡性的內分泌腫瘤，它可以造成全身各系統的損害并危及生命，雖然手術可以明顯改善患者的臨床癥狀，但術后患者的內分泌生化指標不令人滿意，復發率高，因而無法達到生物學治愈。研究表明[1-2]，垂體特異性轉錄因子-1（pituitary-specific transcription factor-1，pit-1）是重要的組織特異性轉錄因子，對生長激素基因表達有著重要的調控作用，不僅可以激活GH基因的表達，而且能夠調控細胞生存和增生所必須的其他相關基因。Pit-1基因在垂體腺瘤的發生及侵襲行為中扮演什么樣的角色，目前尚無相關研究。本實驗通過設計pit-1 siRNA轉染大鼠GH3型垂體瘤細胞，探討pit-1對垂體腺瘤生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠垂體瘤細胞購于美國ATCC細胞庫，F-12k營養富集培養基（美國Gibco公司），馬血清（美國Gibco公司），胎牛血清 （杭州四季青 ），siRNA oligo （Gene Pharma），lipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），RT-PCR （大連寶生物）。P44/42MAPK 一抗（碧云天），Boyden小室（Millipore公司），纖維連接蛋白、Matrigel膠（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將GH3細胞用含15%馬血清+2.5%胎牛血清的F-12K培養基培養，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中常規培養、傳代（2～3 次/周）。

1.2.2 RNA干擾 針對大鼠pit-1基因的三條siRNA oligo由上海吉瑪制藥技術有限公司合成并測序鑒定，序列如下：Pit1-rat-602：5′-GGCUCCGAAUUCAGUCAAATT-3′；Pit1-rat-138：5′-CCUCGGC-UGAUACCUUUAUTT-3′；Pit1-rat-262：5′-GCGACAGGACUUCAUUAUUTT-3′。將狀態良好的細胞接種于6孔板，在24 h內使細胞匯合達到90%，然后應用lipofectamineTM2000，按照說明書步驟進行轉染。轉染后細胞放在CO2培養箱中37℃溫浴24～48 h后，提取細胞總RNA檢測pit-1干擾后的效果。

1.2.3 RT-PCR分析pit-1 mRNA的表達 由Genbank檢索pit-1 mRNA序列，利用Primer3.0在線設計引物并經BLAST檢驗，pit-1 引物正義鏈：5′-ATTCAGTCAAACAACCATCTGC-3′，反義鏈 5′-aAAGTGTCTCTCCAAA-GCATCC-3′，產物長度 273 bp。 β-actin基因上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAA-3′， 下游引物：5′-AGCCACCAATCCACACAG-3′，擴增產物大小173 bp，均由invitrogen公司合成。

1.2.4 提取總RNA 利用oligo（dT）20引物和SuperScript RT試劑盒逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增反應。反應條件：94℃3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環，72℃延伸10 min。PCR引物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙啶染色后，用自動電泳凝膠掃描分析系統采集并分析電泳目的條帶的積分密度值（integrated density value,IDV），將 pit-1 IDV/βactinIDV做為其mRNA水平的相對值，每次實驗至少重復3次。

1.2.5 Boyden小室分析pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響 取對數生長期的細胞接種于6孔板內，每孔3×105/ml，貼壁后，轉染，設空白對照組，陰性對照組及轉染組。

1.2.6 Boyden小室的制備 細胞培養池的多孔PET膜直徑為 6.5 mm， 孔徑 8.0 μm，4℃條件下將1∶3稀釋后基質凝膠（Matrigel Matrix，Becton Dickison Labware產品） 鋪于小室細胞培養池的 PET 內表面，30 μl/孔，放入培養箱，37℃過夜。重懸細胞以不含血清的培養基調整細胞密度為1.5×106/ml，24孔板加入含15%馬血清+2.5%胎牛血清的培養基500 μl。5%CO2，37℃培養箱培養 24 h。

1.2.7 細胞固定、染色和侵襲性的計算 取出Boyden小室用PBS洗2遍，然后將PET的下表面浸泡于70%甲醛中，室溫固定30 min，風干，結晶紫染色10 min，用棉簽擦去上表面細胞，顯微鏡高倍鏡下計數PET膜下面的細胞數（圖2），每個樣本計數5個視野，取平均數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料采用t檢驗、校正的t檢驗，計數資料采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pit-1 siRNA干擾效果的檢測

針對pit-1基因設計三條高特異性siRNA oligo，分別為si138、si262和si602，并通過RT-PCR檢測三條小干擾在GH3垂體腺瘤細胞中對pit-1的敲除效果（圖1）。結果顯示：未轉染和pit-1 siRNA轉染GH3細胞均可檢測到pit-1 mRNA的表達，但兩者比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%～80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內pit-1的表達，實現其基因沉默效應。

2.2 pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響

轉染組、陰性對照組兩組細胞的侵襲力影響：每組分別取4個視野取其均數，結果顯示陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數量明顯多于轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見圖 2。

圖1 pit-1 siRNA轉染GH3細胞24 h后各組細胞pit-1 mRNA的表達水平

圖2 利用Boyden小室測定pit-1 siRNA對GH3細胞侵襲力作用的影響

3 討論

垂體特異性轉錄因子pit-1編碼POU結構域 （PITOCT-UNC domain）中的pit-1蛋白，包含1個POU特異性區域（POU-specific domain，poU-SD）和 1個 POU 同源性區域（Pou-homoeodomain，POU-HD），pit-1 基因在人類位于第 3號染色體，全長43 kb，由6個外顯子和5個內含子組成[3]。有研究發現[4-5]，pit-1有促進垂體細胞增殖的作用，對垂體腫瘤細胞生長起重要作用。許多垂體功能低下的疾病也被認為與pit-1的缺失有關[6]。而關于小干擾技術阻斷pit-1的表達對垂體瘤細胞侵襲作用的影響，相關研究很少。

本實驗設計針對pit-1的siRNA，應用脂質體（lipofectin2000）轉染pit-1的siRNA進入GH3腺瘤細胞，通過RT-PCR檢驗pit-1基因的干擾效果，以探討pit-1基因在GH3腺瘤中的作用。結果未轉染和轉染pit-1 siRNA的GH3細胞均可檢測到pit-1mRNA表達，但兩者比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%～80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內pit-1 mRNA的表達，實現其基因沉默效應。制備Boyden小室測定pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響，結果表明陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數量明顯多于轉染組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。結果證明：干擾pit-1基因對GH3腺瘤的侵襲性有重要的抑制作用。

以pit-1為靶點治療垂體腺瘤，目前國內尚鮮見相關研究。通過本實驗證明：pit-1基因在GH腺瘤的侵襲性方面起著重要作用。通過反義技術可以高效、專一地抑制pit-1的表達，為侵襲性垂體腫瘤的治療提供了一條有益途徑。

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