不同濃度淫羊藿苷對大鼠成骨細胞增殖、分化的影響

錢衛慶，尹 宏，孫海濤

1.南京中醫藥大學第三附屬醫院（南京市中醫院）骨傷科，江蘇 南京 210001；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029

中藥淫羊藿很早即被應用于治療抗骨質疏松癥的復方中[1-2]，但其抗骨質疏松作用機制直到近年才引起人們的高度重視，其中淫羊藿對成骨細胞的作用更是成為此領域的一大研究熱點[3-6]。近年，學者對淫羊藿苷作用于成骨細胞的研究較多，但淫羊藿苷對成骨細胞增殖、分化作用的具體濃度尚存在異議[7-9]，本實驗通過建立大鼠離體成骨細胞培養體系，檢測不同濃度淫羊藿苷對成骨細胞增殖和功能的影響，為進一步探討淫羊藿苷防治骨質疏松的機制奠定實驗基礎。

1 試藥與方法

1.1 藥品及試劑

淫羊藿苷：南京澤朗醫藥科技有限公司；胰蛋白酶：美國Amresco公司；Ⅱ型膠原酶：南京生興生物技術有限公司；堿性磷酸酶染液及堿性磷酸酶活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨細胞的分離和培養

將6只出生后24 h內的SD大鼠（南京軍參照區總院動物試驗中心提供）脫頸處死，取顱骨，具體培養方法見參考文獻[10]。

1.2.2 成骨細胞鑒定

1.2.2.1 堿性磷酸酶定性染色 （偶氮偶聯法）原代培養的成骨細胞生長約85%匯合，0.25%胰酶消化后，接種于鋪有蓋玻片的培養皿。按照堿性磷酸酶染液試劑盒的說明書進行操作。

1.2.2.2 鈣化結節染色 （茜素紅法）原代培養的成骨細胞生長約85%匯合，0.25%胰酶消化后，接種于培養瓶。染色步驟：在培養瓶中用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，三蒸水沖洗 3 次，加入 0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH 8.3）37℃，30 min，三蒸水沖洗，干燥，鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測淫羊藿苷大鼠成骨細胞增殖的影響

以每孔5000個細胞接種于96孔培養板，置于含5%CO2的37℃細胞培養箱中培養24 h后成骨細胞貼壁，按實驗設計，分別加入濃度為 100.0、40.0、20.0、10.0、1.0、0.1 μg/L的淫羊藿苷和無淫羊藿苷的無血清DMEM培養液，在含5%CO2、37℃培養箱中培養24 h。吸棄上清液，每孔加入DMSO液 150 μl，振蕩 10 min，使結晶物溶解，490 nm 波長下測定各孔的光吸收值。

1.2.4 堿性磷酸酶活性檢測

取第2代成骨細胞，以5×104/ml細胞濃度接種于24孔培養板，培養至第5天吸去培養液，各孔分別加入含100.0、40.0、20.0、10.0、1.0、0.1 μg/L 和無淫羊藿苷的無血清 DMEM培養液，放入含5%CO2、37℃培養箱中培養24 h，收集上清液，測定堿性磷酸酶。按照堿性磷酸酶活性測定試劑盒的說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 11.5對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞的鑒定

第3天時，細胞爬片達85%，爬片細胞經堿性磷酸酶染液后，絕大部分細胞染色陽性，細胞核呈紫色，胞膜和胞質出現明顯的紅棕色顆粒（圖1）。培養21 d左右，成骨細胞密集區有不透明黑色顆粒（圖2），經茜素紅染色后，結節區反應陽性，中央染色深，呈深褐色，向周圍逐漸變淺呈橘紅色（圖3）。

圖1 成骨細胞堿性磷酸酶染色（×100）

圖2 成骨細胞的礦化節結（×100）

圖3 成骨細胞的礦化節結茜素紅染色后（×100）

2.2 淫羊藿苷對成骨細胞增殖的影響

100.0 、40.0、1.0、0.1 μg/L 濃度組的淫羊藿苷在第 1、3、5天均能促進成骨細胞增殖，但與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在第 1、3 天 20、10 μg/L 與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而在第 5天只有 10 μg/L濃度組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

2.3 對細胞分化的影響

不同濃度淫羊藿苷均能促進成骨細胞堿性磷酸酶的分泌，其中在第1、2天只有20.0、10.0 μg/L兩組差異有統計學意義（P＜0.05），在第3天只有10 μg/L組差異有統計學意義（P＜0.05），而到了第 5 天各組均無差異（P＞0.05）。 見表 2。

表1 不同濃度淫羊藿苷對成骨細胞增殖的影響（）

表1 不同濃度淫羊藿苷對成骨細胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

100.0 μg/L 組40.0 μg/L 組20.0 μg/L 組10.0 μg/L 組1.0 μg/L 組0.1 μg/L 組對照組組別 第1天0.307±0.0330.331±0.0340.358±0.037▲0.366±0.034▲0.333±0.0310.333±0.0370.291±0.033第3天0.366±0.0390.371±0.0320.389±0.021▲0.392±0.023▲0.368±0.0320.384±0.0270.351±0.032第5天0.306±0.0250.320±0.0290.321±0.0380.331±0.022▲0.318±0.0250.311±0.0290.299±0.011

表2 不同濃度淫羊藿苷對成骨細胞分泌堿性磷酸酶的影響（，U/100ml）

表2 不同濃度淫羊藿苷對成骨細胞分泌堿性磷酸酶的影響（，U/100ml）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

100.0 μg/L 組40.0 μg/L 組20.0 μgL 組10.0 μg/L 組1.0 μg/L 組0.1 μg/L 組對照組組別 第1天2.120±0.0732.083±0.0692.175±0.098 ▲2.292±0.132▲2.101±0.1082.095±0.0692.052±0.051第1天2.313±0.0332.326±0.0702.376±0.061▲2.432±0.076▲2.313±0.0532.282±0.0552.270±0.072第3天2.241±0.0612.253±0.592.265±0.0592.309±0.038▲2.228±0.0552.160±0.0652.204±0.045第4天2.136±0.0802.154±0.0922.167±0.0772.173±0.0802.130±0.0692.105±0.0432.099±0.080

3 討論

3.1 淫羊藿在骨質疏松癥中的運用

淫羊藿作為中藥歷史悠久，現代中藥藥理研究發現，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖[11]。淫羊藿總黃酮是從小檗科淫羊藿屬植物的莖葉中提取的總黃酮類成分，主要含有淫羊藿苷和淫羊藿次苷等，在許多體外細胞培養及體內試驗研究中均發現淫羊藿苷可以有效促進成骨細胞增殖、分化、礦化及增強成骨細胞成骨活性，是一類很有應用前景的中藥單體。

3.2 成骨細胞的發育

細胞增殖是成骨細胞成骨作用的最初階段，其數量不斷增加，并可形成多層細胞，因為成骨細胞能分化合成并分泌大量Ⅰ型膠原蛋白。在成骨細胞分化過程中，堿性磷酸酶大量表達，其表達量的多少，反映出細胞的分化程度和功能狀態。當成骨細胞活動增強時，堿性磷酸酶活性升高，反之則降低。堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期指標。因此，在成骨細胞骨形成過程，其數量和功能直接影響骨形成能力，故本研究主要以成骨細胞的增殖與分化來考量淫羊藿苷對成骨細胞代謝的影響。

3.3 淫羊藿苷對成骨細胞發育的影響

成骨細胞在接種后24 h增殖迅速，此時細胞活力最為旺盛，因此指數生長階段的細胞適用于加入樣品，而在培養72 h進入平臺期后，細胞數趨于穩定，此時測定可以減少實驗誤差。本實驗結果提示淫羊藿苷可促進體外培養大鼠的成骨細胞增殖，促進作用與濃度有關，到了第5天開始時作用較弱，一方面可能是由于藥物濃度及藥效減弱，另一方面由于培養液營養的消耗不能維持細胞生長，培養中也觀察到有較多細胞漂浮死亡，部分貼壁細胞形態皺縮，可能是發生了凋亡，具體明確的原因還有待于進一步的探討。

堿性磷酸酶是參與骨代謝的重要蛋白質，被認為是細胞外基質成熟的早期標志，堿性磷酸酶的活性可以代表成骨細胞的早期分化水平[12]。成骨細胞在接種入培養板的前幾天處于增殖期，堿性磷酸酶分泌低。而細胞長滿培養板底后，細胞進入成熟期，各項功能性產物包括堿性磷酸酶開始分泌，培養液中堿性磷酸酶濃度較高，因此選用此時段收集上清液，檢測堿性磷酸酶。實驗結果提示淫羊藿苷能促進外培養大鼠的成骨細胞的分化成熟，并有一定的濃度依賴性。

綜上所述，本實驗在細胞水平觀察了淫羊藿苷對成骨細胞代謝調控的影響，發現了濃度在10 μg/L時可顯著促進成骨細胞的增殖、分化。實驗結果與有些學者的研究存在差異[1-2]，分析原因，可能由于這方面研究大都基于體外的細胞培養，組織細胞的生存環境在很大程度上有異于體內，另外還存在實驗設計的差異等，這可能是造成實驗結果存在差異的原因。下一步實驗除了加強模擬類人體內微環境等新策略，還應從蛋白、基因等層次去研究淫羊藿苷具體是通過什么途徑促進大鼠成骨細胞的增殖和分化，其深入的研究將為開發抗骨質疏松癥新藥物提供新途徑。

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