復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查方法的研究

王銀娟，陸 崟，巖林萍，王曙東

南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇 南京 210002

磷酸鹽為人體每天必需的無機鹽，能調節維生素D的代謝，維持鈣的內環境穩定，我院根據臨床需要率先開發研制出含有磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的復方磷酸鹽注射液，作為成人靜脈營養治療過程中的磷補充劑，用以滿足人體每天對磷的代謝需求。目前，國內尚未見復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查方法的報道。為了更安全有效地控制其質量，本文依據《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法[1]，對復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查法進行了方法學研究，以期能為同類制劑質量標準的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZH-2自動旋渦混合器 （天津藥典標準儀器廠）；BET細菌內毒素檢查儀（天津藥典標準儀器廠）。細菌內毒素檢查用器具均經250℃干烤1 h以上去除熱原，放冷使用。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品 （CSE）（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200963，規格：120 EU/支）；鱟試劑（TAL，λ=0.5 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司，批號：0904172、0912181；湛江博康海洋生物有限公司，批號：0903113、0912260）；細菌內毒素檢查用水 （WBET，湛江安度斯生物有限公司，批號：0908280，規格：50 ml/支）。復方磷酸鹽注射液 （自制，批號：100204、100523、100613，規格：10 ml/支，家兔熱原檢查合格）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定[2]

根據公式：細菌內毒素限值（L）=K/M。依據藥品使用說明書，成人每次用量為1支（10 ml），將本品加入5%或10%葡萄糖注射液500 ml中進行輸注，在2 h內緩慢輸注完畢。公式中，M為人用每公斤體重每小時最大劑量，中國人均體重按 60 kg 計， 則 M=10 ml/（60 kg·2 h）=0.0833 ml/（kg·h），K為人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，靜脈給藥時 K=5.0 EU/（kg·h）， 則 L=5.0 EU/（kg·h）/0.0833 ml/（kg·h）=60 EU/ml。考慮到臨床聯合用藥的安全性和細菌內毒素的累加性[3-4]，在上述計算限值基礎上將限值要求提高10倍，由此確定復方磷酸鹽注射液的細菌內毒素限值為6 EU/ml。

2.2 鱟試劑靈敏度（λ）復核

按照《中國藥典》2010年版二部鱟試劑“靈敏度復核”項下對2個廠家的TAL進行復核，λc在0.5λ～2.0λ之間，均符合規定。其中陽性指形成凝膠且倒置不變形滑落，陰性指指未形成凝膠或形成凝膠但倒置后變形滑落。鱟試劑靈敏度復核試驗結果，見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.3 供試品的干擾試驗

2.3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的確定 按公式MVD=CL/λ，式中L為供試品的細菌內毒素限值，λ為測試用鱟試劑的靈敏度標示值，C表示供試品的濃度，目前市售鱟試劑λ通常在 0.50～0.03 EU/ml之間，對應的有效稀釋倍數為 12、24、48、100、200。

2.3.2 干擾預試驗 取復方磷酸鹽注射液原液，并用WBET分別將其稀釋 6、12、24、48、100、200 倍制成溶液， 作為供試品溶液（NPC）系列。另制備具有相同濃度的供試液，且每一濃度的供試液中均含2 λ內毒素濃度（1 EU/ml）的供試液，作為供試品陽性（PPC）系列。取2個廠家的TAL（λ為0.5 EU/ml）分別與上述NPC、PPC系列反應，每一濃度重復2次，并按常規設陽性管（PC）和陰性管（NC）對照。預試驗結果表明，復方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應不存在干擾現象。見表2。

表2 復方磷酸鹽注射液的干擾預試驗結果

2.3.3 正式干擾試驗 為了最終確認復方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應是否存在干擾，將供試品原液和WBET分別將CSE制成含內毒素濃度為1.000、0.500、0.250、0.125EU/ml的系列溶液（分別為PPC系列和NPC系列），與2個廠家共4個批號的TAL（λ均為0.5 EU/ml）反應，每一濃度平行4管，并設陰性對照（NC）。正式干擾試驗結果見表3。

表3 復方磷酸鹽注射液的干擾試驗結果

結果表明，2個廠家4個批號的TAL結果Es均在0.5λ～2.0λ 范圍內，Et均在 0.5Es～2.0Es之間，符合《中國藥典》2010年版（二部）附錄細菌內毒素檢查法中的規定。由此確定復方磷酸鹽注射液原液為細菌內毒素檢查中無干擾的最小有效稀釋倍數。

2.4 復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查

取3批經熱原檢查合格的復方磷酸鹽注射液原液，使用靈敏度為0.5 EU/ml的2個不同廠家的鱟試劑，按《中華人民共和國藥典》2010年版（二部）附錄XI E規定的細菌內毒素凝膠限量檢查法對樣品分別進行檢測。復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查結果，見表4。

表4 細菌內毒素檢查結果

綜上所述，3批復方磷酸鹽注射液的細菌內毒素含量均小于6 EU/ml。結果提示，復方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑與細菌內毒素凝集反應無干擾作用，可適用于細菌內毒素的檢查。

3 討論

細菌內毒素限值標準要求定太高可能會使很多批次不能通過檢查，從而造成浪費；標準要求定太低則不能保證藥品質量，危及臨床用藥安全，所以細菌內毒素限值的確定需結合臨床用藥實際，要具合理性。

對復方磷酸鹽注射液樣品進行細菌內毒素檢查時，可以在MVD范圍之內，即小于MVD的倍數下進行試驗，從而減少污染環節，使操作更為便捷、經濟。如果供試品溶液在以不超過MVD的某個稀釋倍數稀釋，檢測結果為陽性時，可對供試品溶液進行進一步稀釋但不能超過MVD，再重新進行試驗。

復方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應無干擾作用，可采用《中國藥典》2010年版二部細菌內毒素檢查法，用靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑對復方磷酸鹽注射液進行檢測。結果表明，本法操作簡單，靈敏快捷、實用性強，并經我院多年臨床使用驗證，該方法安全可靠，可用于復方磷酸鹽注射液的細菌內毒素檢查。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄XI85-88.

[2]王海燕.從細菌內毒素累加的性質看全面質量管理[J].中國現代醫生,2007,45(13):102-103.

[3]李楚云,陳健紅,詹云麗.開展藥學服務控制輸液熱源反應[J].中國現代藥物應用,2010,4(6):218-219.

[4]鄭霞,趙毓梅,劉春.鹽酸卡尼地平葡萄糖注射液細菌內毒素檢查[J].中國藥房,2008,19(1):56-57.