褪黑素對急性腎臟缺血－再灌注損傷小鼠熱休克蛋白表達的影響＊

楊紅英，賈孟良 ，謝守霞，黃 毅，謝 立

(1.廣東省深圳市人民醫院·暨南大學第二臨床醫學院，廣東 深圳 518020;2.廣東省深圳市孫逸仙心血管醫院，廣東 深圳 518020)

缺血－再灌注損傷是臨床常見的病理現象。急性腎缺血較常見于創傷、休克、敗血癥、產后大出血、腎移植等大手術后。在腎缺血－再灌注過程中，會產生腎小管缺血損傷、壞死等，從而損傷腎小管的功能[1－2]。目前對腎缺血－再灌注損傷尚無理想藥物，臨床以營養支持、透析等方法治療，等待腎功能恢復。為尋找抗腎缺血－再灌注損傷藥物，筆者觀察了褪黑素(melatonin)對腎臟缺血－再灌注損傷的組織結構保護作用，探討其對腎臟缺血－再灌注時熱休克蛋白(HSP70)表達的影響，試圖了解褪黑素對腎臟缺血－再灌注損傷的保護作用機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性昆明種小鼠，體重18～22 g，廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號為2007A006，試驗前常規飼養1周，飼養條件為屏障環境(溫度20～25℃，濕度40% ～70%)。褪黑素(美國Sigma公司，批號為25H0904，純度大于99%，使用前用3%乙醇生理鹽水溶解)。熱休克蛋白免疫組化(SABC)試劑盒(武漢博士德公司)，其余試劑及有機溶劑均為分析純。

1.2 試驗方法

造模:小鼠腹腔注10%水合氯醛(30 mg/kg)麻醉，固定后，常規消毒手術區。小鼠腹正中切口，切除右側腎臟，游離左側腎臟，用無創血管夾夾閉左側腎蒂45 min，去除血管夾，肉眼觀察3 min，若左側腎臟灌注后顏色由暗黑轉為紅潤，表示灌注成功，縫合切口，再灌注24 h[3]。

分組與給藥:將小鼠隨機分為4組，褪黑素高、低劑量組(n=10)，術前30 min腹腔分別注射褪黑素10 mg/kg和1 mg/kg，夾閉左側腎蒂缺血45 min，再灌注24 h;缺血－再灌注組(n=10)，術前30 min腹腔注射與治療量等容量的3%乙醇生理鹽水，夾閉左側腎蒂缺血45 min，再灌注24 h;假手術組(n=10)，術前30 min腹腔注射與治療量等容量的3%乙醇生理鹽水，全身麻醉后只切除右腎，縫合切口。4組均在24 h后取血和腎組織。

腎臟病理檢查:腎組織經10%福爾馬林固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm做HE染色，最后在光學顯微鏡下觀察腎小管的結構及腎小球內中性粒細胞的數目。

免疫組化檢測:采用SABC法檢測腎組織中熱休克蛋白的表達。將石蠟包埋的腎組織標本切成4 μm厚切片，然后按以下步驟進行。腎組織石蠟切片脫蠟至水;滴加3%H2O2，室溫放置10 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次;熱修復抗原，切片浸入磷酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復1次，冷卻后磷酸鹽緩沖液洗滌2次;滴加工作濃度一抗，37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;滴加工作濃度二抗，37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;滴加SABC，37℃放置20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;3，3二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下控制反應時間，呈棕黃色為止，蒸餾水洗滌;蘇木素復染;脫水、透明、封片。熱休克蛋白陽性反應為胞漿呈棕黃色染色，不著色者為陰性反應，并采用計算機圖像灰度分析，測定平均灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對腎小球內中性粒細胞的影響

腎臟組織病理檢查，假手術組腎小球、腎小管結構正常，腎小球內偶見中性粒細胞;缺血－再灌注組小鼠左腎血流被阻斷45 min后恢復再灌注24 h，肉眼可見腎皮質較蒼白，腎髓質呈暗紅色，光鏡下可見腎小管上皮細胞腫脹，出現不同程度的變性、壞死，部分腎小管細胞出現混濁腫脹，管腔內可見蛋白管型及脫落上皮細胞，間質充血水腫，腎小球內中性粒細胞數目明顯增多(P＜0.01);褪黑素高、低劑量組小鼠腎臟外觀與假手術組相似，光鏡下僅見部分腎小管細胞輕度腫脹，腎缺血性改變明顯減輕，腎小球內中性粒細胞數目較缺血－再灌注組明顯減少(P＜0.01)。結果見表1。

表1 褪黑素對腎缺血－再灌注損傷小鼠腎小球內中性粒細胞和腎組織熱休克蛋白表達強度的影響()

表1 褪黑素對腎缺血－再灌注損傷小鼠腎小球內中性粒細胞和腎組織熱休克蛋白表達強度的影響()

注:與假手術組相比，＊P＜0.01;與缺血－再灌注組相比，△P＜0.01;▲P ＜0.01。

2.2 對腎組織熱休克蛋白表達強度的影響

各組腎組織均有熱休克蛋白的表達，其中假手術組腎組織僅有少量熱休克蛋白表達;與假手術組相比，缺血－再灌注組腎組織熱休克蛋白的表達顯著增強(P＜0.01);與缺血－再灌注組相比，褪黑素高、低劑量組腎組織熱休克蛋白的表達顯著增強。各組腎組織熱休克蛋白表達強度經圖像分析系統測定結果見表1和圖1。

圖1 各組熱休克蛋白的表達情況

3 討論

持久的腎臟缺血將造成不可逆的損傷，盡快恢復再灌注是治療腎臟缺血的基本保證，但再灌注可能進一步加重腎臟細胞的損傷。缺血－再灌注導致的組織細胞損傷主要與活性氧自由基產生、膜脂質過氧化、細胞內鈣超載、能量消耗、細胞骨架紊亂等密切相關。在腎缺血－再灌注損傷過程中，腎臟在黃嘌呤氧化酶催化下，由次黃嘌呤生成尿酸的過程中，產生大量的活性氧自由基損傷組織。循環中的中性粒細胞與腎血管內皮細胞的黏附和隨后的中性粒細胞激活與浸潤，可降低腎小球濾過率和腎小管的重吸收，加劇腎缺血－再灌注損傷[2]。

研究顯示，褪黑素是迄今為止發現的最強、最有效的自由基清除劑和抗氧化劑，可通過多種途徑發揮抗缺血－再灌注損傷方面保護作用[4－6]。褪黑素通過發揮自身的自由基清除劑作用，以及增加谷胱甘肽(GSH)、減少缺血－再灌注后心肌組織中丙二醛(MDA)產生等抗氧化作用，減少心肌組織細胞凋亡和壞死，從而減少缺血再灌注后心臟的梗死面積[6]。褪黑素可以降低缺血再灌注后肝組織的氧化損傷程度，減少多形核白細胞(PMN)的浸潤[7]。缺血后使用褪黑素處理可以減少額腦區的一氧化氮(NO)、環磷酸鳥苷(cGMP)、活化型一氧化氮合酶(iNOS)，同時減少微血管中黏附因子的生成和附壁白細胞的數目，減輕缺血再灌注后組織器官微循環的無復流現象[8]。光鏡觀察結果表明，褪黑素對急性腎缺血－再灌注損傷具有保護作用。

熱休克蛋白在正常細胞中水平較低，而在應激狀態下顯著升高，在缺血、缺氧等情況下，如局灶及全腦缺血后受損細胞內的變性蛋白可誘導熱休克蛋白表達。熱休克蛋白等內源性物質在腎臟缺血－再灌注損傷中有重要作用，其對缺血－再灌注腎臟的保護作用可能與以下機制有關:抑制腎組織的炎癥反應[9];熱休克蛋白發揮分子伴侶作用穩定缺血時Na+－K+－ATP酶在細胞骨架上的錨著，穩定細胞骨架[10];減輕Ca2+介導的細胞損傷[11]。

本研究結果顯示，假手術組小鼠腎小球、腎小管結構正常，僅有少量熱休克蛋白表達;缺血－再灌注組小鼠腎小管上皮細胞腫脹，出現不同程度的變性、壞死，熱休克蛋白表達較假手術組顯著增強，這是由于缺血本身為一種應激反應，可誘導其表達，而且也是機體調動內源性保護機制，發揮細胞保護作用;褪黑素高、低劑量組缺血性改變較缺血再灌注組明顯減輕，接近正常，熱休克蛋白表達豐富。熱休克蛋白表達的上調，可能是褪黑素對腎缺血細胞在轉錄和翻譯水平上調熱休克蛋白的表達，從而使其合成增加，使得腎臟對缺血及氧化損傷的抵抗能力增加，顯著改善小鼠腎臟缺血－再灌注的損傷。

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