JAK2-STAT3通路對七氟烷后處理在體大鼠缺血/再灌注心肌的影響

顏麗暉，江曉菁

(中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，遼寧沈陽 110001)

心肌缺血/再灌注損傷是臨床常見的病理過程，也是心肌梗死的發病以及心肌血運重建治療過程的核心環節，如何尋求有效的心肌保護措施，減輕心肌的缺血/再灌注損傷，一直是近年來研究的熱點。2003年Zhao等［1］研究發現，在犬心肌缺血/再灌注損傷模型中，于再灌注開始階段實施幾次短暫缺血/再灌注循環可以明顯減少再灌注后心肌梗死面積、心肌組織水腫以及炎癥反應，從而首次提出了缺血后處理的心肌保護概念。在隨后的一系列研究中發現［2］，缺血后處理在小鼠、大鼠、家兔及犬等多物種缺血/再灌注損傷模型中均具有心肌保護作用，明顯減少心肌缺血/再灌注損傷。近年來，許多研究發現異氟烷等吸入麻醉藥后處理能模擬缺血后處理，對缺血/再灌注損傷心肌具有保護作用［3－4］，可能通過一系列機制發揮作用。JAK2-STAT3信號通路作為細胞內的一條重要的信號傳導途徑，參與介導細胞生長、增殖分化、炎癥、凋亡等多種生理過程，它與心肌缺血/再灌注引起的心功能障礙及缺血預處理和后處理誘導的心肌保護關系密切［5－6］，然而，吸入麻醉藥后處理的心肌保護作用是否與此有關尚不明確。七氟烷在臨床上應用廣泛，本研究采用吸入七氟烷后處理活體大鼠缺血/再灌注心肌，通過觀察它對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響，驗證其對心肌的保護作用并探討JAK2-STAT3信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 七氟烷(雅培公司);2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、伊文藍、AG-490、SB、DMSO(Sigma公司);戊巴比妥 (上海泰瑞爾生物技術有限公司);磷酸化STAT3及STAT3抗體、磷酸化JAK2及JAK2抗體、β-actin抗體(Cell Signaling美國);辣根酶標記山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)，蛋白分子標準及化學發光系統(Cell Signaling，美國)。

1.2 動物與分組 成年健康♂ SD大鼠75只，體重250～300 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為5組(n=15):假手術組(S)、缺血/再灌注組(CON)、AG-490組(AG)、七氟烷后處理組(Sevp)、七氟烷后處理+AG490組(AG+Sev-p)。采用結扎左冠狀動脈前降支30 min、再灌注120 min的方法制備心肌缺血/再灌注模型。假手術組左冠狀動脈前降支穿線并不阻斷冠狀動脈。AG-490組在再灌前10 min靜注JAK2抑制劑AG-490(3 mg·kg－1)，七氟烷后處理組在再灌注前2 min吸入2.8%七氟烷，持續5 min，七氟烷后處理+AG490組在再灌注前2 min吸入2.8%七氟烷，持續5 min，再灌前10 min靜注JAK2抑制劑AG-490(3 mg·kg－1)，各組均以 5ml·kg－1·h－1的速率靜脈輸注生理鹽水維持至術畢。缺血后10 min和30 min、再灌后30、60、120 min記錄心率(HR)、平均動脈壓(MAP)和心率－收縮壓乘積(RPP)。各組隨機取10只大鼠于再灌120 min后處死，TTC染色法測定心肌梗死面積。各組另取5只大鼠，于再灌注開始后的10 min處死，取出左心室心肌組織，提取總蛋白，Western blot法分析心肌JAK2、STAT3和磷酸化JAK2、STAT3的蛋白表達變化。見Fig 1。

Fig 1 Experimental protocol

1.3 動物模型制備 腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉后，分離左側股靜脈置入小兒頭皮針，以備輸液和給藥;右頸動脈插管，連接監護儀監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)。肢導心電圖連續監測Ⅱ導聯心電圖。RPP(rate-pressure product)按如下公式計算:MAP×HR1000－1。溫度探頭插入直腸監測中心體溫。用恒溫電熱板維持中心體溫在(36.5～37.5)℃之間。氣管切開插管后連接DW-2000型小型動物呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司)行機械通氣，呼吸頻率60 次/min，潮氣量20ml·kg－1。于左側心臟搏動處縱行切開皮膚約3 cm，于3～5肋間開胸，充分暴露心臟，切開心包，在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，于左心耳根部下方1 mm處進針，以6/0縫線穿過心肌表層，肺動脈圓錐旁出針，待心電圖恢復穩定10 min后，結扎冠狀動脈左前降支，取小段聚乙烯管用于結扎處以避免損傷冠狀動脈。以心電圖明顯改變，結扎處遠端心肌顏色變成灰白作為成功阻斷冠狀動脈心肌缺血的標志。阻斷30 min后松開結扎線。看到缺血處心肌恢復紅色作為心肌再灌注的標志。

1.4 觀察指標

1.4.1 血流動力學指標觀察 記錄麻醉后穩定30 min(術前基礎值)、缺血10、30 min和再灌注5、30、60、120 min 時心率(HR)、平均動脈壓(MAP)、RPP。1.4.2 缺血和梗死心肌范圍測定 心肌再灌注120 min后，重新在原結扎處結扎左前降支。經右頸動脈插管逆行注入1%的Evans藍溶液，使心肌未缺血區染成藍色。迅速切下心臟，將所有的心房和右心室組織去除，置于－20℃冰箱冷凍30 min后，從心尖到心底部橫行將心臟切成厚度基本相同的5片，并按順序編成1～5號。將心臟切片放入1%TTC溶液中37℃染色15 min。TTC將有活性的心肌組織染成磚紅色而梗死心肌則呈現灰白色，而未缺血區則為藍色。10% 福爾馬林固定24 h后，每個心臟切片頭側向上進行數碼照相，然后稱重。左心室(left ventricle，LV)、缺血區(area at risk，AAR，非藍色區)和心肌梗死區(infarct size，IS，灰色區)面積用Image–Pro Plus 6.0軟件計算。梗死心肌重量按如下公式計算:梗死心肌重量=(A1×W1)+(A2×W2)+(A3×W3)+(A4×W4)+(A5×W5)(A:梗死心肌面積占左心室面積的百分比;W:心臟切片的重量;1～5:為心臟切片編號)

1.4.3 Western blot 每組另取5只大鼠，在再灌注開始10 min后處死動物，快速取出心臟。剪取缺血危險區心肌后，立刻置于液氮保存。提取心肌組織總蛋白，采用組織裂解液裂解，取樣品30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電泳轉至硝酸纖維素膜，轉膜成功后，將硝酸纖維素膜用封閉液在室溫下封閉，1 h后加入相應的一抗體，4℃過夜，再與相應的二抗于室溫下作用1 h，免疫反應性條帶用化學發光系統檢測，測定磷酸化JAK2、STAT3和總JAK2、STAT3的表達水平，X線照相記錄。實驗重復3次，β-actin作為內參照。蛋白條帶用Quantity One軟件測積分灰度值，以各組蛋白表達量與β-actin比值進行半定量分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行分析，計量資料以±s表示，組內比較采用重復測量數據的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 動物排除標準 75只大鼠中有4只大鼠被淘汰，1只死于操作技術失誤引起的大出血(Sev-p組)，3只在缺血/再灌注期間死于心律失常(1只為AG組，2只為CON組)，差異無統計學意義。

2.2 血流動力學變化 各組指標基礎值間無差異。與S組相比較，其它各組在再灌注30 min時及其后的MAP、HR和RPP均明顯下降(P＜0.05)。與其它組相比較，Sev-p組和Sev-p+AG490組，在后處理5 min時，MAP、HR和RPP均明顯下降(P＜0.05)，但經歷10 min洗脫期后，再灌注期后期，各指標變化趨勢一致，組間比較差異無統計學意義。Sev-p組與Sev-p+AG490相比較，二者的血流動力學變化差異無統計學意義(P＞0.05)。見Tab 1。

2.3 缺血和梗死范圍 大鼠重量(body weight)、左心室的重量(LV weight)、缺血區重量(AAR weiht)和心肌缺血范圍(AAR/LV)各組間比較差異無顯著性(P＞0.05)。與CON組、AG+Sev-p組比較，Sev-p組的梗死面積明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。AG+Sev-p組、AG組的梗死區面積與CON組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 2，Fig 2，3。

2.4 JASK2-STAT3通路蛋白表達量的變化 Sevp組缺血區心肌組織可以明顯上調再灌后10 min的JAK2、STAT3的磷酸化水平，與其它組相比具有統計學意義(P＜0.05)，而AG+Sev-p組與Sev-p組相比較，JAK2、STAT3的磷酸化水平明顯降低，具有統計學意義(P＜0.05)。AG組與 CON組比較，JAK2、STAT3的磷酸化水平差別無統計學意義(P＞0.05)。見 Fig 4，5。

Fig 2Infarct size expressed of the area at risk(±s)

Tab 1Hemodynamic data(±s)

Tab 1Hemodynamic data(±s)

*P＜0.05 vs CON;▲P＜0.05 vs others

Group n Baseline Ischemia Reperfusion 10 min 30 min 5 min 30 min 60 min 120 min HR/bpm S 10 340±15 334±35 328±19 325±28 346±16▲ 330±25▲ 337±37▲CON 8 350±20 350±21 338±19 335±18 319±18 300±15 297±15 Sev-P 9 354±20 348±22 332±20 301±19* 325±20 311±18 304±19 AG+Sev-P 10 346±29 349±25 329±22 298±22* 322±23 314±23 291±37 AG 9 353±23 346±20 335±18 324±17 313±18 308±17 289±16 MAP/mmHg S 10 109±7 115±8 106±6 100±6 102±4▲ 108±5▲ 98±25▲CON 8 111±11 118±10 99±10 90±9 82±28 82±7 66±22 Sev-P 9 116±12 96±10 95±9 71±8* 89±6 80±6 76±5 AG+Sev-P 10 105±9 102±10 92±9 68±10* 92±8 81±8 79±7 AG 9 110±8 100±5 93±6 90±6 93±4 87±5 74±25 RPP(HR-MAP/1000)S 10 37±7 39±6 35±4 36±2 34±8▲ 38±6▲ 35±9▲CON 8 33±5 37±4 32±3 30±7 29±6 26±3 22±3 Sev-P 9 38±3 41±8 33±4 22±3* 26±3 30±7 21±7 AG+Sev-P 10 40±5 36±4 30±6 17±8* 30±3 28±5 24±4 AG 9 38±13 33±3 34±3 30±6 23±2 20±6 21±4

Tab 2Weight and size of area at risk(±s)

Tab 2Weight and size of area at risk(±s)

*P＜0.05 vs CON;#P＜0.05 vs AG+Sev-p

Group n Body weight/g AAR/LV/% IS/AAR/%CON 10 229±46 41±23 52±8 Sev-p 9 300±50 37±23 25±7*#AG+Sev-p 10 312±14 46±32 38±9 AG 9 288±43 38±16 49±6 S 10 298±31 － －

Fig 3 Representative images of left ventricle sample in respective group

3 討論

Fig 4 Expression of protein JAK2 after 10 min of reperfusion

大鼠冠狀動脈側支循環少、重復性好、價格低廉，是研究心肌缺血/再灌注的經典實驗動物［7］。研究表明，大鼠短暫缺血30 min后未見凋亡細胞數目增多，再灌注120 min即可在缺血區心肌檢測到凋亡細胞［8］，據此本實驗采用結扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min的方法制備在體心肌缺血/再灌注損傷模型。而ARR/LV(缺血區重量/左心室重量)組間比較差異無統計學意義，顯示各組大鼠冠狀動脈左前降支供血范圍變異小，阻斷部位基本一致，心梗模型制備的效果肯定。為了避免雌激素通過多種機制產生心肌保護作用［9］，以及其他因素如低氧、非梗阻性冠脈低灌注等對心肌引起預處理效應［10］，本實驗均采用♂大鼠，避免缺氧，充分補液，維持血流動力學平穩，同時選用不對心肌梗死范圍影響的戊巴比妥麻醉［11］。Obal等［12］的研究表明，2 min吸入1MAC的七氟烷可以最大限度的減少心肌梗死面積，而增加用藥時間則會降低其心肌保護作用。參照該實驗和預實驗結果，本實驗選擇2.8%的七氟烷5 min的后處理時間。

Fig 5 Expression of protein STAT3 after 10 min of reperfusion

JAK-STAT信號通路是1992年發現的涉及免疫、細胞增殖分化、細胞凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理、病理生理過程的重要細胞內信號轉導通路。JAK是一類胞質內非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶，迄今已發現4種家族成員，即JAKl、JAK2、JAK3及TYK2。STATs是一種能與靶基因調控區DNA結合的胞質蛋白家族，STATs在人和哺乳動物中已發現有 7 個家族成員，STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。許多細胞外信號能夠激活JAK－STAT通路，這些細胞外信號與靶細胞上相應的受體結合后首先活化蛋白激酶JAK，活化的JAK進一步使胞質中的轉錄因子STAT磷酸化而激活，兩個磷酸化的STAT分子形成二聚體并轉位到細胞核，與靶基因調控區DNA結合，調節靶基因的表達，從而發揮多種生物學效應［13］。該通路在心肌缺血/再灌注損傷以及缺血預處理心肌保護機制中具有重要作用［14］，其中 JAK2-STAT3通路在缺血/再灌注損傷以及內源性心肌保護機制中的作用尤為重要。大量研究已證實［15－17］，JAK2-STAT3 通路在缺血預處理，特別是預處理的晚期心肌保護機制中具有核心地位，它通過上調抗凋亡蛋白比例、以及NOS與COX-2等保護蛋白發揮心肌保護作用。

Hattori等［15］發現預處理可以激活JAK2-STAT3通路，抑制心肌細胞凋亡，減少心梗面積，這些作用可以被AG490阻斷。本實驗中，在吸入七氟烷后處理前靜注特異性JAK2抑制劑AG490，與單純吸入七氟烷后處理相比，其梗死區占缺血區體重的百分比由(25±7)%升至(38±9)%，與對照組(52±8)%相比，部分消除了七氟烷后處理對心肌梗死面積的影響作用。說明JAK2-STAT3通路在吸入七氟烷后處心肌保護中同樣具有重要作用，至少部分介導了其心肌保護作用。

有研究發現，心肌梗死區和邊緣區均有JAK2，STATI，STAT3過度表達，STATl和 STAT3激活對心肌具有相反的作用，STAT3激活抑制凋亡，發揮心肌保護作用，而 STATl激活卻誘發凋亡［18－19］，因而推測，在七氟烷的后處理過程中，激活的STAT3的數量由于超過STATl從而表現出對心肌的保護作用。

總之，本研究結果說明七氟烷后處理作為抗心肌缺血/再灌注損傷的一種新方法，可以減少再灌注心肌的梗死面積，改善再灌注后心臟的血流動力學，前景廣闊，而該保護作用與JAK2-STAT3通道的介導密切相關。

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