應用SELDI技術與MATLAB軟件預測替吉奧聯合欖香烯治療消化道腫瘤敏感性的前瞻性研究

吉利娜，黃 金，陳 妍，裴 毅

山西省腫瘤醫院老年病科，山西太原 030013

替吉奧是一種氟尿嘧啶衍生物口服抗癌新藥，其單藥治療轉移性晚期結腸、直腸癌有效率可達35.5%[1]，欖香烯（Elemene）作為中藥溫郁金中提取的抗癌有效成分，目前已發現其可用于肺癌、晚期消化道腫瘤等實體腫瘤的治療，其對惡性胸腔積液的局部治療效果也很明顯，具有抗癌譜廣、安全、無毒、與化療聯合使用可以協同抗癌的作用。前期研究已發現能預測替吉奧治療消化道癌的敏感性指紋[2]，本研究以此為基礎探索替吉奧聯合欖香烯治療消化道癌敏感性的指紋，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

7例經術后病理報告確診的消化道腫瘤患者均來自我院老年病科，其中，男4例，女3例；年齡52～83歲；其中，大腸癌5例，胰腺癌1例，肝轉移1例，腹膜轉移1例，合并腹腔積液1例。根據WHO實體腫瘤療效評價標準將替吉奧聯合欖香烯治療1個療程后的患者分成穩定組（SD）和無效組（PD）。

1.2 治療方法

所有患者均采用替吉奧聯合欖香烯治療。替吉奧用法為口服，通常根據患者的體表面積計算首次給藥的基準量，即80～120 mg/（m·2d），2次/d，早飯后和晚飯后各服1次，連服28 d，之后停藥14 d，此為1個周期，可以反復進行。聯合欖香烯用法為600 mg加入0.9%氯化鈉注射液內靜滴15 d，1次/d，治療期間若病情進展或副作用較大不能耐受時停藥。

1.3 血清蛋白質檢測

1.3.1 標本采集及處理 治療前取清晨空腹末梢靜脈血3 ml，靜置，3000 r/min離心5 min，分離血清，-80℃冰箱保存。血清標本水浴解凍，10000 r/min 離心 2 min，取 5 μl樣品，加 10 μl 9M尿素，振蕩30 min，加180 μl緩沖液稀釋 （100 mmol/L NaOAc，pH 4.0），4℃ 10000 r/min 離心 2 min，取上清待用。

1.3.2 實驗方法 ①芯片預處理：將芯片安裝到Bioprocessor上，每孔加 200 μl結合緩沖液（100 mmol/L NaOAc，pH 4.0），振蕩5 min，拍干，重復1次；每孔上樣100 μl血清樣品，室溫振蕩1 h，甩去液體；用200 μl結合緩沖液洗2次，每次5 min，拆下芯片，待芯片自然干燥，每點加SPA（50%乙腈和0.5%三氟乙酸的飽和溶液）0.5 μl 2次，干燥待測。②數據收集：用加有All-in-one標準蛋白質的NP 20芯片校正質譜儀，設定儀器參數，在Ciphergen Protein Chip軟件中設定讀片程序讀取芯片數據，其中，橫坐標為蛋白質質荷比（M/Z），縱坐標為蛋白質相對含量（豐度）。

1.4 統計學方法

利用蛋白指紋圖譜儀自帶的Biomarker Wizard 3.1軟件對兩組血清有相同質荷比的蛋白質含量數據進行分析，得出含量有顯著性差異的蛋白質峰，P<0.05為差異有統計學意義。用MATLAB 7.0.1軟件對每個差異蛋白指紋的豐度數據進行曲線擬合得出相應的曲線及曲線方程，觀察每條曲線是否具函數關系。

2 結果

2.1 7例消化道腫瘤患者的基本指紋情況 見圖 1、2。

圖1 7例患者的蛋白質譜圖

圖2 7例患者的蛋白模擬電泳圖

2.2 兩組差異蛋白質含量情況

設定參數分別對兩組所得指紋圖譜進行分析，治療穩定組和無效組有6處蛋白質含量差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 差異蛋白質組的豐度擬合曲線圖

經MATLAB 7.0.1軟件對差異指紋的豐度數據進行曲線擬合。兩組的差異指紋豐度與療效均呈函數關系，其中，M/Z為9277、9555的曲線豐度呈穩定的上升趨勢，豐度與療效呈反比例關系；M/Z 為 4467、7959、15903、15064 的曲線豐度呈穩定的下降趨勢，豐度與療效呈正比例關系。見圖3。

表1 兩組差異蛋白質含量情況比較（±s）

表1 兩組差異蛋白質含量情況比較（±s）

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3 討論

有研究表明替吉奧反應性好，依從性高，與氟尿嘧啶比較其能維持較高的血藥濃度并提高抗癌活性，安全性好。也有研究表明欖香烯對胃癌[3]、肝癌[4]等消化道腫瘤有確切療效，與化療同時聯合欖香烯可起到增強抗癌作用、改善帶瘤機體病理、生理狀態以及輔助和調整的作用[5]。抗腫瘤藥物的治療效果主要取決于藥物的耐藥性[6]，其只能通過治療后影像學或血清學指標的變化表現出來，但這時可能已經喪失了最佳的治療時機。目前，醫學研究證明，耐藥的基礎與某種蛋白質的含量增多有關[7]，由于SELDI技術可以海量捕捉未知蛋白質，并以指紋圖形式（峰型及豐度）準確描述和量化[8]，因此本研究通過比較已知替吉奧聯合欖香烯治療晚期消化道癌療效的腫瘤患者血清蛋白質指紋，捕獲能預測其療效的血清蛋白質指紋。

本研究根據實體瘤療效評價標準判斷療效并以此分組，所以臨床療效的準確判斷是本研究的關鍵。然而目前惡性腫瘤療效的評價，是以腫塊縮小程度判斷，如穩定期（SD）的評價是腫塊增大與縮小程度均<25%，而在實際應用中25%的判斷是模糊的，從而影響到以療效進行分組的分析，因此作為分組的測定值必須進行療效函數曲線擬合，以客觀地界定療效區間，實現正確分組。本研究的蛋白質指紋在M/Z界定后療效的判斷以豐度確定，作為療效判斷的豐度值呈現函數關系，如果這種函數關系不存在，說明腫瘤實際變化與檢測結果有誤差。因此筆者采用MATLAB軟件先對差異指紋的豐度值進行曲線擬合，觀察耐藥蛋白質含量與療效是否呈函數關系，以確定研究的可行性。

圖3 替吉奧聯合欖香烯治療消化道腫瘤是否耐藥的標識指紋的豐度擬合曲線圖

本研究共選擇7例患者，其中，化療后穩定者4例，無效者3例。圖1、2為研究對象的基本指紋情況，經統計分析后，M/Z 為 4467、7959、9277、9555、15903、15064 的蛋白 質 指 紋在兩組間存在明顯差異。圖3為6個差異指紋的擬合曲線，可以看出穩定組和無效組的差異指紋（質荷比）與療效均呈函數關系，其中M/Z為9277、9555的曲線豐度呈穩定的上升趨勢，豐度與療效呈反比例關系；M/Z為4467、7959、15903、15064的曲線豐度呈穩定的下降趨勢，豐度與療效呈正比例關系。本研究借助于MATLAB 7.0.1軟件對每個差異指紋的豐度數據進行曲線擬合得出相應的擬合曲線均呈有意義的線性函數關系，因此采用SELDI技術得出的差異指紋豐度高低和消化道癌患者療效的函數關系是存在的。

綜上所述，經SELDI技術檢查，指紋圖譜M/Z為4467、7959、9277、9555、15903、15064 為預測替吉奧聯合欖香烯治療消化道癌敏感性的指紋標識。其中，M/Z 9277、9555為低表達，M/Z 4467、7959、15903、15064 為高表達， 為預測替吉奧聯合欖香烯治療消化道癌獲得了穩定的標識指紋。下一步的研究應是對有價值的指紋豐度做進一步驗證，獲取療效標準界定值，使之更好的服務臨床。

[1]Othsu A,Baba H,SakataY,et al.Phase II study of S-l,a novel oral fluoropyfin idine derivative in patients with metastatic colorectal cancer[J].Br J Cancer,2000,83(2):141-145.

[2]吉利娜,黃金,陳妍,等.蛋白質指紋技術與MATLAB軟件聯合應用預測S-1(替吉奧)膠囊治療消化道癌耐藥的前瞻性研究[J].中國醫學創新,2010,7(26):161-163.

[3]韋巧玲,壽佳威.替吉奧聯合欖香烯聯合氟尿嘧啶/紫杉醇治療進展期胃癌的臨床觀察[J].浙江臨床醫學,2008,10(5),588-589.

[4]譚詩生,李杭,李雪松,等.持續替吉奧聯合欖香烯乳經皮左鎖骨下動脈植入藥盒灌注化療轉移性肝癌的臨床研究[J].中國實用醫藥,2008,3(30):12-14.

[5]Dickson RB.Understanding of the molecular basis of drug resistance in cancer reveals new targets for chemotherapy[J].Trends in Pharmacol Sci,1990,11:305.

[6]Fojo AT.Expression of a multiple drug resistance gene in human tumors and tissues[J].Proe Natl Acad Sci,1987,84:265.

[7]Kartner N.Cell surface P-glyloprotien is associated with MDR in mammal ian cell[J].Science,1983,221:1285.

[8]謝莉,馬小軍,魏淑青,等.用SELDI技術預測吉非替尼療效的前瞻性研究報告[J].現代生物醫學進展,2008,8(10):1498-1500.