非清髓性供者造血干細胞移植對腎移植受者免疫功能的影響

吳書一 ，劉文剛 ，董秀娟 ，羅明霞 ，葛永超 ，王志余 ，趙曉武 *

1.鄭州市第三人民醫院干細胞與器官移植實驗室，河南鄭州 450000；2.鄭州市第三人民醫院血液科，河南鄭州 450000；3.鄭州市第三人民醫院泌尿外科，河南鄭州 450000

目前，腎臟移植已成為終末期腎病的有效治療手段之一，隨著新型免疫抑制劑的廣泛應用，腎移植1年人/腎存活率已經達到90%以上，但移植物長期存活率沒有得到明顯改善。慢性排斥反應和免疫抑制劑的不良反應仍是影響腎移植長期存活的主要因素[1]。誘導受體對移植腎特異性的免疫耐受可以減少排斥反應的發生、減少免疫抑制劑用量，提高移植腎的長期存活。目前，誘導免疫耐受的方法主要是供者特異性輸血和供者特異性造血干細胞移植[2]。本研究對48例腎移植受者進行了非清髓性的供者特異性造血干細胞移植，并觀察其免疫功能變化，以探討其誘導免疫耐受、降低排斥反應的可行性及安全性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集1998年1月～2005年12月在我院行供體特異性造血干細胞移植的腎移植患者48例，設為觀察組，患者均為女性，年齡20～48歲，平均34歲。收集同期接受同一供者另一腎臟的腎移植患者48例，設為對照組，患者均為女性，年齡22～49歲，平均36歲。供者為48例健康男性，年齡20～50歲，平均35歲。供、受者ABO/Rh血型相同，補體依賴性淋巴細胞毒交叉配型試驗（CDC）≤10%，受者術前檢查群體反應性抗體（PRA）均為陰性，依據氨基酸殘基配型原則，HLA-A、B、DRB1為1～2位點錯配。供體熱缺血時間少于8 min，冷缺血時間少于8 h。

1.2 方法

1.2.1 骨髓采集、處理與移植 取腎的同時，于供者的雙側髂前、髂后上棘及胸骨部位，采集骨髓200～380 ml，ACD抗凝，經過去除脂肪、血漿、部分紅細胞后濃縮為80～100 ml，加入等體積的細胞冷凍保護液，經程序降溫后置-196℃液氮中保存。常規方法行腎移植，造血干細胞移植的預處理方案采用ATG（德國，Fresenius，兔抗）3 mg/（kg·d），連用 5 d，腎移植術后第14天，將冷凍的骨髓于42℃水浴中快速復溫，立即輸注，輸注的單個核細胞數為（0.9～2.5）×108/kg，臺盼藍拒染率為（93±4）%。

1.2.2 預防排異的治療方案 移植后應用三聯免疫抑制劑環孢素 A 5 mg/（kg·d）[或普樂可復 0.1 mg/（kg·d）]、嗎替麥考酚脂1.5 mg/d、潑尼松30 mg/d。兩組隨訪1～10年，觀察急性排斥反應發生率及5年人/腎存活率。所有受者均經醫院倫理道德委員會討論批準，并與患者簽署知情同意書。

1.2.3 標本采集 于移植后第30、60、90、360天同一時間點留取外周血標本：血清2 ml，肝素抗凝血4 ml。

1.2.4 試劑與儀器 抗 CD3、CD4、CD8、CD19、CD25 購自美國BD 公司（Becton，Dicki-nson and Company）；IL-10、TNF-α 細胞因子檢測試劑購自深圳晶美生物工程公司；主要儀器FACS Calibur流式細胞儀：美國BD公司，ELX800型酶標分析儀（美國Bio-Tek公司）

1.2.5 檢測方法 應用流式細胞儀直接免疫標記技術檢測淋巴細胞亞群，T 淋巴細胞選擇 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+，B淋巴細胞選擇CD19+。酶聯免疫法檢測細胞因子IL-10、TNF-α。

1.3 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，百分率比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

移植后隨著時間延長，觀察組CD3+、CD4+、CD19+細胞百分比及TNF-α濃度持續降低，與對照組相比，60 d后CD3+、CD4+、CD19+下降最明顯（P<0.05），之后穩定在一個水平；觀察組CD8+降低不明顯，但CD4+/CD8+比值明顯降低；觀察組CD4+CD25+百分比及IL-10濃度持續升高，與對照組相比，CD4+CD25+百分比90 d時升高最明顯 （P<0.05），IL-10濃度30 d時升高最為明顯（P<0.05）。結果見表1。

表1 觀察組與對照組，移植后不同時間段免疫學指標變化的比較（±s，n=48）

表1 觀察組與對照組，移植后不同時間段免疫學指標變化的比較（±s，n=48）

注：移植后同一時間段，與對照組相比，*P<0.05

兩組急性排斥反應發生率：觀察組為12%，低于對照組（29%），兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；隨訪5年人/腎存活率，觀察組為100%/100%，對照組為100%/88%。

3 討論

非清髓性供體特異性造血干細胞移植是指在腎移植后通過相對較經典、預處理強度較低的非清髓性誘導治療來抑制受者的免疫應答，使供者造血干細胞在受體內得以植入，再經過免疫抑制劑應用，以期達到宿主和移植物之間的雙向免疫耐受，提高腎移植患者長期存活率。Spitzer等[3]報道1例多發性骨髓瘤繼發腎功能衰竭患者，經環磷酰胺、抗胸腺細胞球蛋白（ATG）和胸腺照射處理后，采取HLA配型相合的骨髓聯合腎臟移植，術后2個月停用免疫抑制劑，腎功能正常，無排斥反應發生。Kawai等[4]報道，腎移植聯合骨髓輸注患者5例，移植后9～14個月停用免疫抑制劑，移植腎功能仍保持穩定2～5年。傅耀文等[5]報道61例腎移植后接受供者特異性骨髓輸注，可以誘導嵌合體發生，提高受者對供者的免疫耐受，降低排斥反應發生率。王志余等[6]報道3例活體親屬腎移植，首先對供體進行外周血動員，采集外周血干細胞，于腎移植后2周分次輸注，能更好地促進微嵌合形成，更有利于產生免疫耐受。

本文主要觀察供體特異性造血干細胞移植對腎移植受者免疫功能的影響，探討免疫耐受及排斥反應發生情況。T細胞亞群主要分為CD4陽性輔助性T細胞和CD8陽性抑制性T細胞。CD4輔助性T細胞（Th）又分為Th1和Th2細胞，能介導免疫應答，分泌多種具有調節細胞功能的高活性、多功能低分子蛋白即細胞因子，在移植免疫中發揮重要作用。Th1細胞分泌的細胞因子（IL-2、TNF-α等）能促進細胞免疫應答，激活天然殺傷細胞，特異性殺傷移植物抗原，啟動排斥反應。Th2細胞分泌的細胞因子（IL-10等）是一種強有力的免疫抑制和炎癥抑制因子，抑制免疫排斥和炎癥的發生。Th1和Th2細胞間動態平衡對誘導和維持免疫耐受十分重要[7]。因此，腎移植受者T細胞亞群和T細胞分泌的細胞因子檢測，一定程度上反映了T細胞的活化程度，幾種不同的細胞因子聯合檢測可反映不同輔助性T細胞亞群的活化狀態。

移植后隨著時間延長，觀察組CD3+、CD4+細胞百分比持續降低，與對照組相比，60 d 后 CD3+、CD4+下降最明顯（P<0.05），之后穩定在一個水平；觀察組CD8+降低不明顯，但CD4+/CD8+比值明顯降低，表明受者免疫功能處于明顯的免疫抑制狀態，有利于降低排斥反應的發生。CD4+CD25+調控T細胞具有免疫抑制及誘導活化的T細胞成為免疫無能兩大功能特征，是機體維持自身耐受的重要組成部分，其對免疫反應具有抑制效應[6]。觀察組CD4+CD25+持續升高，與對照組相比，90 d時升高最明顯（P<0.05），提示受者形成免疫耐受，呈現低免疫反應狀態；IL-10為Th2細胞分泌的抑制性細胞因子，觀察組IL-10持續升高，與對照組相比，30 d時升高最為明顯 （P<0.05），也提示受者免疫功能受到抑制。TNF-α為Th1細胞分泌的促炎癥因子和免疫抑制因子，觀察組 TNF-α持續降低，與對照組相比，60 d時降低最為明顯（P<0.05），提示可減少炎癥反應的發生，降低排斥反應，受者免疫功能受到進一步抑制。CD19+是B淋巴細胞的表面標志，觀察組CD19+持續降低，與對照組相比，60 d時下降最明顯（P<0.05），之后穩定在一個水平，提示B淋巴細胞功能受到抑制，從而可以減少排斥性抗體的分泌，降低排斥反應的發生率。隨訪結果表明，觀察組急性排斥反應發生率明顯低于對照組（12%vs 29%，P<0.05）；5 年人/腎存活率，觀察組高于對照組（100%/100%vs 100%/88%）。

本研究發現，盡管觀察組與對照組都使用了免疫抑制劑環孢素A，但從免疫重建結果來看，觀察組的CD4+CD25+調節性T細胞、IL-10明顯增多，與環孢素A參與免疫抑制IL-2、TNF-α分泌減少的藥理機制無關。顯然輸注同一供者骨髓干細胞，可以通過抑制性T細胞克隆的增加，改變了受體免疫重建后的淋巴細胞群系，從而可能誘導了受體的免疫耐受。

本組結果提示供體特異性造血干細胞移植能夠抑制腎移植受者CD3+、CD4+、CD8+T細胞免疫功能，使患者處于低免疫反應狀態；增強CD4+CD25+調節性T細胞功能，有利于誘導免疫耐受；同時，又能夠抑制B淋巴細胞，減少排斥性抗體的分泌，降低排斥反應發生率，對提高人/腎存活率具有重要作用。

筆者認為，供體特異性造血干細胞移植是一種安全、有效地誘導腎移植免疫耐受的臨床治療方法，能夠降低排斥反應的發生，其更深層次的免疫機制有待進一步探討。

[1]董磊,段美麗,李昂.腎移植術后不同階段感染病原學特征分析[J].臨床和實驗醫學雜志,2006,5(4):308-310.

[2]黃君齡,王祥慧.供者特異性輸注誘導腎移植受者免疫耐受的研究進展[J].上海交通大學學報:醫學版,2009,29(7):877-881.

[3]Spitzer TR,Delnonico F,Tolkoff-Rubin N,et al.Combined histocompatibility leukocyte antigen-matched donor bone marrow and renal transplantation for multiple myeloma with end stage renal disease:the induction of allograft tolerance through mixed lymphohe-matopoietic chimerism[J].Transplantation,1999,68(4):480-484.

[4]KawaiT,CosiniAB,SpitzerTR,etal.HLA-mismatchedrenaltransplantation without maintenance immunosuppression[J].N Engl J Med,2008,358(4):353-361.

[5]傅耀文,王偉剛,周洪瀾,等.腎骨髓聯合移植與嵌合體發生及急性排斥反應的關系[J].中華醫學雜志,2004,84(23):1983-1985.

[6]王志余,葛永超,趙曉武,等.腎-骨髓聯合移植誘導免疫耐受:能夠促進移植后嵌合體的形成嗎？[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(53):10457-10460.

[7]何維.醫學免疫學[M].北京:人民衛生出版社,2005:188-205.