60株鮑曼不動桿菌喹諾酮類耐藥基因分析

曹 陽，馬全玲，魏殿軍，趙 猛

(天津醫科大學第二醫院，天津 300211)

近年來，多重耐藥鮑曼不動桿菌引起感染的報道明顯增多，由于該菌對常用抗菌藥物耐藥嚴重，臨床治療棘手，因此常造成醫院內感染的暴發流行。以往認為造成細菌喹諾酮耐藥的機制主要是靶位基因的變異、外膜孔蛋白通透性下降和外排泵的作用，以上機制均由染色體所介導。近年來，質粒介導的喹諾酮類耐藥機制引起國內外學者廣泛關注［1，2］，但關于質粒介導的喹諾酮類耐藥基因的發現幾乎均存在于腸桿菌科細菌中，而在非發酵菌中質粒介導的耐喹諾酮基因僅有個別報道［3］。近期我們對天津地區2009年鮑曼不動桿菌喹諾酮類耐藥基因情況進行了分析，旨在探究鮑曼不動桿菌喹諾酮類耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年1～12月天津三所三級甲等醫院各類臨床標本，包括痰、血液、傷口分泌物等中分離的非重復鮑曼不動桿菌60株。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922，銅綠假單胞菌 ATCC 27853。質粒介導喹諾酮類耐藥基因 qnrA、qnrB、qnrS、acc(6')-Ib-cr、qepA陽性對照株由上海華山醫院抗生素研究所王明貴教授惠贈。

1.2 藥物敏感試驗 采用肉湯稀釋法測定鮑曼不動桿菌各種藥物的最低抑菌濃度(MIC)，抗菌藥物包括環丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、阿米卡星、頭孢噻肟、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素、頭孢西丁、復方新諾明、亞胺培南、氯霉素、氨曲南、左氧氟沙星、美羅培南。判定標準參考CLSI 2009版規定。

1.3 喹諾酮類耐藥基因檢測

1.3.1 模板DNA提取 采取煮沸法。將臨床分離鑒定的鮑曼不動桿菌接種到含有5 ml LB液體培養基的試管中，37℃震蕩培養16～18 h，6 000 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀用20 μl雙蒸水渦旋混勻，95℃煮沸10 min，冰浴5 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清與等量的氯仿(約200 μl)混勻，4℃ 12 000 r/min離心2 min，小心吸取上清，上清即為用于PCR擴增的模板，放于－20℃保存備用。

1.3.2 qnrA、qnrB、qnrS、qepA、acc(6')-Ib、gyrA 和parC基因擴增 ①引物設計:參照文獻［4～7］，PCR產物的大小分別為 580、617、427、509、548、343、327 bp。②PCR反應體系:總體積25 μl。其中 premix Taq 酶 12.5 μl，上下游引物各 1 μl，DNA 模板 3 μl，去離子水7.5 μl。試劑購自寶生物工程有限公司。qnrA、qnrB、qnrS、qepA、acc(6')-Ib 基因 PCR 循環參數:95℃預變性10 min，95℃變性1 min，55℃ 退火1 min，72℃延長1 min，循環35次，最后72℃延伸10 min。gyrA和parC基因擴增的循環參數:95℃預變性15 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環30次;最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。③parC和gyrA基因的酶切分析:取 10 × H buffer 2 μl，10 U/μl的內切酶 Hinf I 1 μl，PCR 基因擴增產物 10 μl，去離子水 7 μl，37 ℃ 水浴2 h，3%瓊脂糖凝膠電泳。④測序分析:PCR陽性結果交由北京華大基因研究中心純化并測序。采用美國國家信息中心(NCBI)在線分析工具Blastn程序進行分析，以確定耐藥基因型或基因變異情況。

2 結果

2.1 鮑曼不動桿菌的藥物敏感性 鮑曼不動桿菌對環丙沙星、頭孢他啶、阿米卡星、頭孢噻肟、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素、頭孢西丁、復方新諾明、亞胺培南、氯霉素、氨曲南、美羅培南的耐藥率分別為61.7%、41.7%、23.3%、41.7%、16.7%、33.3%、85%、45%、15%、71.7%、61.7%、15%。

2.2 qnrA、qnrB、qnrS、acc(6')-Ib、qepA 基因檢測結果 qnrA、qnrB、qnrS和qepA基因PRC產物電泳結果均為陰性。acc(6')-Ib基因PCR產物12株陽性。見圖1。

圖1 acc(6＇)－Ib基因電泳圖

2.3 acc(6')-Ib基因測序分析 未發現喹諾酮耐藥變異基因acc(6')-Ib-cr。

2.4 gyrA和parC基因Hinf I酶切結果 PCR擴增gyrA基因均獲得大小為343 bp的產物。經內切酶Hinf I酶切后，環丙沙星敏感菌的擴增產物均能被Hinf I酶切，產生291 bp和52 bp的2條片段;37株耐藥菌中30株(81.0%)的擴增產物不能被Hinf I酶切，仍為343 bp。PCR擴增parC基因均獲得大小為327 bp的產物。經內切酶Hinf I酶切后，敏感菌的擴增產物均能被Hinf I酶切，產生206 bp和121 bp的2條片段;37株耐藥菌中26株(70%)的擴增產物不能被Hinf I酶切，仍為327 bp，見圖2和圖3。

2.4 gyrA和parC基因序列分析 未被酶切的耐藥菌株gyrA基因，Hinf I酶切位點GAN TC中的C突變為T，導致喹諾酮決定區(QRDR)第83位(相應于大腸埃希菌)的絲氨酸被亮氨酸取代，而消失了酶切位點(GAN TC)。未被酶切的耐藥株parC基因，Hinf I酶切位點GAN TC中的C均突變為T，造成QRDR第80位(相當于大腸埃希菌)的絲氨酸被亮氨酸取代。能被酶切的耐藥菌株與敏感株的gyrA和parC基因均無突變。

3 討論

不動桿菌屬在醫院分布廣泛，是引起醫院感染的常見病原菌，常從患者的呼吸道分泌物、尿液、血液等標本中分離出來，為條件致病菌，在非發酵菌感染中僅次于假單胞菌。鮑曼不動桿菌是臨床最常見的不動桿菌，約占不動桿菌屬的70%以上;醫院感染近年來較多，且較為嚴重［8］。本研究中不乏多重耐藥，甚至泛耐藥株，應引起高度重視。

圖2 gyrA基因PCR產物HinfⅠ酶切圖

圖3 parC基因PCR產物HinfⅠ酶切圖

喹諾酮類藥物是治療不動桿菌感染的有效藥物之一，具有良好的體外抗菌活性、組織滲透性等優點。但隨著喹諾酮類藥物的廣泛應用，在臨床分離出各種相應的耐藥菌株，且耐藥率逐漸上升，給臨床治療帶來困難。研究表明，細菌對喹諾酮類藥物產生的耐藥機制較為復雜，主要涉及藥物作用靶點改變、細菌外膜變化和藥物的主動外排等方面。

本研究對臨床分離的60株鮑曼不動桿菌可能存在的質粒介導的喹諾酮類耐藥基因進行了PCR篩查，并未出現任何陽性結果。考慮篩查結果陰性的原因如下:首先，本次研究篩查的樣本量偏小(60株)，此應為主要原因，與國外相關報道一致［9］;第二，由于目前為止在鮑曼不動桿菌等非發酵菌內發現質粒介導的喹諾酮類耐藥基因僅有個別報道［3］，說明質粒介導喹諾酮類耐藥基因在非發酵菌中還不普遍;第三，本研究中PCR篩查所使用的引物均參考自腸桿菌相同耐藥基因研究的文獻，考慮腸桿菌與非發酵菌之間同源性方面存在較大差異，可能造成引物不能與目的基因互補，從而導致結果陰性;第四，天津地區關于質粒介導喹諾酮類耐藥基因的報道僅見于本院感染研究所李紅等［10］腸桿菌相關基因的研究，從側面說明質粒介導喹諾酮類耐藥基因在天津地區呈低流行趨勢。

綜上所述，染色體基因gyrA和parC的基因突變仍是鮑曼不動桿菌喹諾酮耐藥的主要原因，而其他未發現染色體突變的耐藥菌可能與主動外排泵或外膜變化相關。

［1］Jacoby GA，Chow N，Waites KB.Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47(2):559-562.

［2］Wang M，Sahm DF，Jacoby GA，et al.Emerging plasmid-mediated quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in the United States［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(4):1295-1299.

［3］楊仁國，俞汝佳，高燕渝，等.臨床分離鮑曼不動桿菌耐藥性及qnr基因檢測［J］.中國抗生素雜志，2009，34(12):747-749.

［4］Cattoir V，Poirel L，Rotimi V，et al.Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterobacterial isolates［J］.J Antimicrob Chemother，2007，60(2):394-397.

［5］Teo JW，Ng KY，Lin RT.Detection and genetic characterisation of qnrB in hospital isolates of Klebsiella pneumoniae in Singapore［J］.Int J Antimicrob Agents，2009，33(2):177-180.

［6］Jiang Y，Zhou Z，Qian Y，et al.Plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac(60)-Ib-cr in extended-spectrum blactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in China［J］.J Antimicrob Chemother，2008，61(5):1003-1006.

［7］Ma J，Zeng Z，Chen Z，et al.High prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnraac(6＇)-Ib-crand qepA among ceftiofur-resistant Enterobacteriaceae isolates from companion and food-producing animals［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(2):519-524.

［8］尤佳女，王寅，馬春芳.鮑曼不動桿菌的分離及其耐藥性變遷［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18(1):186-187.

［9］Robicsek A，Jacoby G，AHooper DC.The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance［J］.Lancet Infect Dis，2006，6(10):629-640.

［10］李紅，宋詩鐸，王玉寶，等.腸桿菌科臨床株質粒介導的喹諾酮類耐藥機制的研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2007，30(11):1256-1259.