低氧條件下喉癌Hep-2細胞Stat3和HIF-1α表達關系的研究

路秀英 李曉明

缺氧是人類和動物實體腫瘤的一個共同特征。低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是機體在低氧條件下產生的一個轉錄因子，它能指導多種低氧反應基因的轉錄，對于VEGF的激活有重要意義。信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)信號通路在人類多種腫瘤中持續激活，影響腫瘤細胞增殖、凋亡、浸潤及轉移。研究發現內部存在低氧情況的實體腫瘤如Hep-2細胞Stat3的激活與低氧時間存在一定聯系，對于細胞的生長、增殖和轉移產生重要影響，并可能對HIF-1α的調節具有重要作用。本文應用喉癌Hep-2細胞體外實驗檢測低氧條件下p-Stat3表達和HIF-1α表達的關系，并進一步檢測應用反義寡核苷酸抑制p-Stat3表達對低氧時HIF-1α表達的影響，旨在探明低氧時喉癌Hep-2細胞p-Stat3表達和HIF-1α表達的關系，為靶向Stat3的喉癌基因治療新策略奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人喉癌細胞系Hep-2購買自中國科學院上海生命科學院，在含有10%新生小牛血清與RPMI 1640培養基中培養。MTT為Sigma公司產品。脂質體LipofectamineTM 2000為Invitrogen公司產品。全硫代修飾Stat3 AS-ODN和S-ODN由上海生工生物技術公司合成。

1.2 方法

1.2.1 低氧條件設置 低氧培養實驗條件為37℃、5%CO2、2%O2、93%N2，實驗在特制的低氧培養箱中進行，具體制作參見參考文獻［1］。培養結束后抽取細胞培養液作血氣分析(IL1400型血氣分析儀，Instrmentation Labrotory，USA)，氧分壓為(2.9 ～4.7kPa)，低于常氧對照組氧分壓(21.1～21.3kPa)，達到低氧培養要求。

1.2.2 低氧處理 進入對數生長期細胞隨機分組為常氧及低氧3、6、12、24h組，按分組時間分別收集細胞，流式細胞技術檢測p-Stat3、HIF-1α及VEGF蛋白表達。每組設平行對照3例，實驗重復3次。

1.2.3 基因轉染及檢測 隨機分組為空白對照組、脂質體對照組、Stat3 AS-ODN(100、200nmol/L)轉染組、Stat3 S-ODN(100、200nmol/L)轉染組。實驗用Stat3 AS-ODN序列為5’GCT CCA GCA TCT GCT TC 3'全硫代修飾、Stat3S-ODN序列為5'GAA GCA GAT GCT GGA GC 3’全硫代修飾(上海生工生物工程公司合成)。細胞轉染過程按轉染試劑盒說明書進行。轉染后置入常氧培養環境24h后置入低氧環境培養，6h后收集細胞，進行以下實驗:①通過MTT法檢測細胞存活率。96孔板中每孔加入MTT(5g/L)20μl，繼續孵育4h，棄上清，加入甲臜溶解每孔100μL，振蕩10min，檢測波長570nm的吸光度(OD)值。計算細胞存活率=(實驗組OD/對照組OD)×100%。每組設平行對照3例，實驗重復3次。②流式細胞技術檢測p-Stat3、HIF-1α及VEGF蛋白表達。取1×106/ml細胞懸液1ml加入一抗(單克隆抗體工作液)0.1ml，室溫孵育30min，加入 PBS 10ml洗滌 1次，800r/min離心5min，棄上清，加入二抗(FITC-Ig)工作液100μl，避光室溫孵育 30min，加入 PBS 10ml洗滌，離心同上。棄上清液除去未結合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 0.1ml，經500目銅網過濾后上機檢測。采用美國Beckman Coulter公司生產的Epics-XLII型流式細胞儀。上機檢測得到X-Mode值，樣本均道值=340Log(X-mode)，以熒光指數(FI)表示蛋白的相對含量。樣本的熒光指數(FI)=實驗樣本均道值/正常對照樣本均道值。每組設平行對照3例，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

應用SPSS 13.0統計學軟件對數據處理。計量資料采用單因素方差分析;組間相關性分析使用pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧對Hep-2細胞p-Stat3、HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響及相關性分析

p-Stat3在低氧3h即出現蛋白表達增高，增長至6h后保持穩定(6h組與12、24h組相比差異無統計學意義，P＞0.05)。HIF-1α在低氧3h組與常氧組比較差異無統計學意義(P＞0.05);在低氧6h組與常氧組比較明顯增高(P＜0.05);在低氧12h和24h繼續增高，與常氧比較差異有統計學意義(P＜0.01)。VEGF在低氧3h和6h組與常氧組比較差異無統計學意義(P＞0.05);在低氧12h和24h組與常氧組比較明顯增高(P＜0.01)。見表1。

經 Pearson 相關檢驗分析，3、6、12、24h各組p-Stat3與對應HIF-1α FI呈直線正相關(r=0.691，P＜0.01);p-Stat3與VEGF FI有明顯相關性(r=0.581，P＜0.01);HIF-1α與 VEGF FI呈顯著直線正相關(r=0.947，P ＜0.01)。

2.2 Stat3 AS-ODN對低氧條件下Hep-2細胞p-Stat3、HIF-1α、VEGF 蛋白表達的影響

低氧條件下Stat3 AS-ODN轉染組、Stat3 S-ODN組、脂質體對照組 p-Stat3 FI分別為0.82±0.03、1.02±0.05、1.00±0.02;HIF-1α FI分別為 0.60±0.13、0.97±0.05、0.96±0.03;VEGF FI分別為0.34±0.22、0.87 ±0.16、0.91 ±0.10。Stat3 AS-ODN 轉染組3種蛋白表達與Stat3 S-ODN組和脂質體對照組相比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

經 Pearson’s相關分析 p-Stat3、HIF-1α、VEGF 兩兩之間均呈直線正相關。(p-Stat3 and HIF-1α r=0.912，P ＜0.01;p-Stat3 and VEGF r=0.790，P ＜0.05;HIF-1α and VEGF r=0.712，P ＜0.05)。

2.3 不同濃度Stat3 AS-ODN轉染后Hep-2細胞存活率的變化

不同濃度 Stat3 AS-ODN(100、200nmol/L)轉染Hep-2細胞，同時設不同濃度Stat3 S-ODN(100、200nmol/L)轉染Hep-2細胞對照和單純脂質體作用于Hep-2細胞對照，培養24h再置于低氧條件下培養6h，然后檢測細胞存活率，結果發現Stat3 ASODN轉染各組與脂質體對照組和Stat3 S-ODN對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)，而Stat3 SODN轉染100、200nmol/L組與脂質體對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

表1 低氧不同時間對Hep-2細胞p-Stat3、HIF-1α和VEGF表達的影響()

表1 低氧不同時間對Hep-2細胞p-Stat3、HIF-1α和VEGF表達的影響()

注:＊＊與對照組比較，P＜0.01;*與對照組比較，P＜0.05。

組別 p-Stat3 HIF-1αVEGF對照組1.04±0.03 0.91±0.32 1.00±0.18低氧3h 1.12±0.03* 1.00±0.30 1.06±0.14低氧 6h 1.12±0.03＊＊ 1.87±0.83* 1.08±0.14低氧12h 1.16±0.05＊＊ 3.91±0.67＊＊ 1.71±0.26＊＊低氧 24h 1.12±0.05* 5.04±0.51＊＊ 2.20±0.75＊＊

圖1 不同濃度Stat3 AS-ODN轉染后Hep-2細胞存活率的變化

3 討論

隨著分子生物學研究技術的進步，基因治療越來越受到重視。研究熱點之一的Stat3是轉錄信號傳導子與激活子家族(signal transducers and activators of transcription，STATs)的重要成員，廣泛表達于不同類型的腫瘤細胞和組織中，介導多種細胞因子和生長因子的信號傳導，影響眾多靶基因的轉錄。喉癌等多種實體腫瘤內細胞為乏氧細胞，低氧條件下腫瘤更具有侵襲性，易發生遠處轉移。Lee等報道在乳腺癌細胞低氧條件也可以作為獨立因素刺激Stat3激活［2］。

在我們的實驗中發現，喉癌Hep-2細胞低氧3h即出現p-Stat3蛋白表達增強，6h后其表達則基本平穩，6h和12h HIF-1α及VEGF蛋白表達才逐漸出現增高，因此Stat3可能是Hep-2細胞適應低氧的啟動步驟，但由低氧誘導的Stat3通路尚不完全明了。除了原有較為明確的705位酪氨酸磷酸化后聚合活化外，727位絲氨酸磷酸化很可能與低氧誘導Stat3激活有著更為密切的關系。在關于乳腺癌的研究中發現低氧條件可以誘導STATs發生不同程度的激活，其中Stat3在人乳腺癌細胞(MCF-7)中的活化與絲氨酸磷酸化的Stat3呈明顯的正相關，提示由低氧誘導的磷酸化很可能與Stat3上的727位點上絲氨酸進行磷酸化修飾有關［2］。Stat3的激活很可能在 HIF-1α的降解作用受阻過程中起到了穩定HIF-1α蛋白減少降解的作用，使HIF-1α蛋白在細胞內保持高濃度。Jung等［3］在人腎癌細胞關于低氧的研究中發現HIF-1α C’端577-826位氨基酸是低氧下與p-Stat3結合的位點。另外有研究表明，p-Stat3可以在RNA水平促進腫瘤組織HIF-1α表達［4］。p-Stat3通過 HIF-1α調控VEGF表達，進而影響腫瘤新生血管形成。本研究應用Stat3反義寡核苷酸后，由低氧誘導的p-Stat3、HIF-1α及VEGF表達受到明顯抑制。一方面肯定了Stat3反義寡核苷酸對于Stat3信號轉導通路高效特異的阻斷作用，另一方面也證實了p-Stat3在低氧誘導HIF-1α、VEGF激活過程中必不可少的重要地位。Xu等研究發現小分子Stat3阻斷劑阻斷Stat3可明顯降低腫瘤細胞系DU145及A2058中HIF-1α和VEGF的活化［5］。Gray等在胰腺癌細胞及前列腺癌細胞試驗中發現由氯化鈷摸擬低氧條件可得到基本相同的結論，低氧下 Src依賴的VEGF的活化受HIF-1α、p-Stat3等的調節［6］。這與我們的實驗結論基本相同，在缺少p-Stat3的情況下，Hep-2對于低氧的適應性將有所降低。

總之，Stat3 AS-ODN轉染 Hep-2細胞可阻斷Stat3通路，抑制腫瘤細胞增殖，同時阻斷由于低氧誘導的HIF-1α、VEGF表達，從而降低腫瘤細胞低氧適應性，減少腫瘤血管生成，抑制腫瘤進展。靶向Stat3的干擾技術可成為喉癌基因治療的新策略，本研究為其臨床應用提供了新的實驗依據。

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