芬太尼對人肝癌細胞bel-7404生長與凋亡的影響

鄒春云 阮 林 張 援

阿片受體激動劑嗎啡是臨床常用的鎮痛藥物，廣泛應用于各種癌痛患者，療效確切，但其對腫瘤細胞是促進其生長還是誘導其凋亡尚存在爭議［1～4］，這在一定程度上限制了嗎啡的臨床應用。近年來，阿片受體激動劑芬太尼作為一種常用麻醉性鎮痛藥物，正逐漸應用于癌痛患者，但該藥對腫瘤細胞的影響國內外報道較少。本實驗通過觀察芬太尼對人肝癌細胞bel-7404增殖、細胞周期及細胞凋亡的影響，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枸椽酸芬太尼注射液(批號:090501，湖北宜昌人福藥業有限公司)，人肝癌細胞bel-7404引自中科院上海生物研究所，由廣西醫科大學腫瘤防治研究所培養。主要培養試劑包括小牛血清、RPMI 1640培養液，胰蛋白酶為GIBCO產品，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自吉泰科技有限公司。細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。儀器包括ELX800型全自動酶標儀(BIOKIT公司)、FACScalibur型流式細胞儀(BD公司，美國)和Axiovert200型倒置顯微鏡(Zeiss公司，德國)等，細胞周期分析軟件(Beckman公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞接種于含100μg/m1青霉素、100μg/m1鏈霉素和10%小牛血清的1640培養液中，置于含5%CO2、飽和濕度、37℃的培養箱中培養。待細胞形成單層鋪滿70% ～80%時，用0.25%胰酶常規消化，以1∶3～1∶5傳代1次。

1.2.2 噻唑藍還原法(MTT)及顯微鏡觀察細胞形態 將細胞接種于96孔培養板中，細胞密度為1×103個/孔，繼續培養至細胞長滿80%后，棄培養液，4個實驗組分別施加濃度為5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各組復設空白對照孔(僅加培養基)，各濃度設4個平行孔。培養24h后，取出96孔培養板，用倒置顯微鏡觀察細胞形態，加入新鮮配制5mg/ml的MTT20μl/孔，孵育4h，吸盡各孔內殘余液體，加入二甲基亞砜(DMSO)200μl/孔，振蕩10min，使微小黑色結晶溶解，形成均勻藍紫色溶液。采用酶標儀波長490nm下測定各孔吸光度值(A)，以不加細胞僅加培養基的孔調零。

1.2.3 細胞凋亡檢測 收集對數生長期的bel-7404細胞，將2×105/ml細胞接種于6孔培養板，1ml/孔，實驗組施加濃度分別為為5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各組復設空白對照孔(僅加培養基)3孔/組，待細胞長到約80%時，收集細胞，參照 annexin VFITC試劑盒說明書方法操作，在488nm的激發波長下采用FACScalibur流式細胞儀分析。

1.2.4 細胞周期分析 收集對數生長期的bel-7404細胞，將細胞以2×105/ml密度接種于6孔培養板，同樣設4個實驗組與1個對照組，待細胞長到80%后，收集細胞，參照試劑盒說明書操作，采用FACScalibur流式細胞儀進行單色熒光細胞流式計數，用細胞周期分析軟件進行細胞周期分析。

1.2.5 克隆形成實驗 收集對數生長期的bel-7404細胞，將細胞以1×103/ml密度接種于6孔培養板，芬太尼孵育7 d，以 PBS洗滌細胞2次，甲醇固定5min，結晶紫染色15 min，在Axiovert200型倒置顯微鏡下觀察克隆數，≥50個細胞計為1個克隆，計算克隆形成率，克隆形成率(%)=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差()表示，各樣本間比較采用單因素方差分析，多重比較使用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芬太尼對人肝癌細胞bel-7404生長、凋亡與克隆形成率的影響

各實驗組人肝癌細胞bel-7404 MTT值和克隆形成率明顯低于對照組，細胞凋亡率顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.01或0.05)。芬太尼濃度≥50ng/ml時，隨著濃度的增加，凋亡率逐漸升高，MTT值、克隆形成率逐漸降低，各實驗組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 各組MTT值、細胞凋亡率及克隆形成率結果()

表1 各組MTT值、細胞凋亡率及克隆形成率結果()

注:對照組與各實驗組比較，*P＜0.05。

組別MTT值(n=4)凋亡率(%)(n=3)克隆形成率(%)(n=3)對照組 0.609±0.015* 10.71±1.8* 12.59±0.32*F1 0.572±0.010 26.27±2.08 10.48±0.43 F2 0.546±0.006 28.88±1.06 8.06±0.37 F3 0.502±0.007 32.10±1.4 6.66±0.28 F4 0.481±0.007 47.27±1.33 4.48±0.45

2.2 芬太尼對細胞周期的影響

各實驗組對bel-7404細胞周期的作用不完全相同(P＜0.01)，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，細胞周期分析顯示芬太尼干預細胞后實驗組隨濃度增加，G0/G1期比例逐漸增加，S期、G2/M期細胞比例逐漸減少，與對照組比較，各實驗組在G1期均有顯著統計學差異(P＜0.01)，G2期除5ng/ml與500、5 000ng/ml組間差異有統計學意義(P＜0.01)外，其余各實驗組間兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，S期除5ng/ml與50ng/ml組兩者間差異無統計學意義(P=0.07)外，其余各實驗組間兩兩比較，差異均有顯著統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度的芬太尼對人肝癌bel-7404細胞周期的變化(，%)

表2 不同濃度的芬太尼對人肝癌bel-7404細胞周期的變化(，%)

注:對照組與各實驗組比較，*P＜0.05。

組別 G1 G2S對照組 48.60±1.54* 19.37±1.2* 32.06±1.45*F1 62.98±2.08 10.96±1.12 26.06±1.08 F2 66.85±1.07 9.30±0.89 23.84±0.39 F3 71.05±1.38 8.18±0.88 20.71±2.15 F4 75.64±1.89 7.74±0.91 16.62±1.00

2.4 細胞形態觀察

倒置顯微鏡下觀察對照組細胞貼壁生長，細胞呈多角形或梭形，細胞質豐富，生長旺盛，相鄰細胞生長融合成片。加入不同濃度的芬太尼后，隨著濃度增加和作用時間延長，細胞開始變小、變圓，折光性增強，脫壁細胞逐漸增多，漂浮在培養基中。見圖1a，1b。

圖1a 對照組細胞形態(10×40)

圖1b 實驗組不同芬太尼濃度下細胞形態(10×40)

3 討論

芬太尼作為一種臨床常用的阿片受體激動劑，其廣泛的藥理作用受到越來越多的關注，在治療惡性腫瘤方面，有研究表明該藥能明顯抑制MCF-7細胞的增殖［5］，并可抑制人胃癌細胞活力［6］，但該藥對 bel-7404細胞是否存在抗增殖效應尚未見報道。本研究結果表明，各實驗組人肝癌bel-7404細胞MTT值和克隆形成率明顯低于對照組(P＜0.01)，提示不同濃度的芬太尼對bel-7404細胞的生長均有抑制作用。當芬太尼濃度≥50ng/ml時，隨著濃度的增加，凋亡率逐漸升高，MTT值、克隆形成率逐漸降低，提示高濃度的芬太尼對bel-7404細胞的生長具有更加明顯的抑制作用。在形態學方面，本研究發現，經芬太尼處理的細胞，其活力下降，細胞變小且形態不均，貼壁能力降低，且呈劑量依賴性特征。

為了進一步了解芬太尼引起bel-7404細胞凋亡的機制，我們用流式細胞儀檢測實驗組細胞周期的變化，發現實驗組bel-7404細胞出現明顯的G0/G1期細胞周期阻滯，靜止期(G0/G1期)細胞增多，DNA合成活躍期(S期)和有絲分裂(G2/M)期細胞減少，反映細胞增殖狀況的S期細胞比率在經芬太尼處理24h后明顯降低，表明芬太尼能抑制bel-7404細胞從G0/G1期向S期的轉化。由于細胞的增殖速度主要與G1期的長短有關，阻滯細胞從G1期進入S期就可以抑制細胞增殖。因此，芬太尼抑制人肝癌細胞bel-7404生長的原因之一可能是抑制細胞從G0/G1期向S期轉化，結果與部分報道一致［5］。但也有研究表明［7］，阿片類藥物可以與細胞表面μ受體結合，β受體進而與G蛋白三聚體結合，促進細胞內NO產生和釋放，下調NK-KB和bcl-2的表達，上調bax和p53的表達，從而誘發細胞凋亡。劉志恒等［8］研究也推測，芬太尼誘導細胞凋亡的機制可能是通過與細胞表面μ受體結合而發揮作用。由此可見，芬太尼可能具有組織特異性及腫瘤選擇性，對不同腫瘤的作用方式不盡相同。

綜上所述，芬太尼在體外可劑量依賴性抑制人肝癌bel-7404細胞生長并促進其凋亡，其機制之一可能是誘導細胞周期，尤其是G0/G1期阻滯。

［1］ Biji M，Lennon F，Siegler J ，et al.The novel role of the muopioid receptor in lung cancer progression:A laboratory investigation［J］.Anesthesia and Analgesia，2011，112(3)∶558-567.

［2］ Franchi S，Panerai AE，Sacerdote P.Buprenorphine ameliorates the effect of surgery on hypothalamus-pituitary-adrenal axis，natural killer cell activity and metastatic colonization in rats in comparison with morphine or fentanyl treatment［J］.Brain，Behavior，and Immunity，2007，21(6)∶767-774.

［3］ Mouedden M，Meert TF.The impact of the opioids fentanyl and morphine on nociception and bone destruction in a murine model of bone cancer pain［J］.Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2007，87(1)∶30-40.

［4］ Hatsukari I，Hitosugi N，Ohno R，et al.Induction of apoptosis by morphine in human tumor cell lines in vitro［J］.Anticancer Research，2007，27(2)∶857-864.

［5］ 張咸偉，丁漢琳，張傳漢.芬太尼對MCF-7細胞增殖和細胞周期影響研究［J］.中國醫師雜志，2005，7(1)∶23-25.

［6］ 覃 怡，利 莉，陳 靜.芬太尼對人胃癌MGC-803細胞活力的影響［J］.中華麻醉學雜志，2010，30(6)∶705-707.

［7］ Notas G，Kampa M，Nifli AP，et al.The inhibitory effect of opioids on HepG2 cells is mediatedvia interaction with somatostatin receptors［J］.European Journal of Pharmacology，2007，555(1)∶1-7.

［8］ 劉志恒，高 峰，田玉科.嗎啡、芬太尼、曲馬多對Jurket細胞核因子κB和IL-2合成的影響［J］.中國醫院藥學雜志，2007，27(1)∶579-582.