去甲斑蝥素對NCI-H446骨轉移裸鼠模型的干預作用

高志棣 潘 琪 高 偉 馬曉業(yè) 朱峰青

近年來中醫(yī)藥在骨轉移癌的治療中取得一些較好的療效。中醫(yī)藥已經(jīng)廣泛應用于各類骨轉移癌的治療，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥既可止痛，又可抗癌，并能增強免疫及促進骨髓造血功能，提高抗病能力，減少放化療毒副反應，明顯改善晚期患者生存質量的防治優(yōu)勢。但是臨床上有關中藥治療腫瘤骨轉移實驗研究的報道很少。去甲斑蝥素(norcantharidine，NCTD)是我國自行研制生產(chǎn)的新型抗腫瘤藥物，是中藥抗癌活性成分斑蝥素 (can，CA)去除1，2位兩個甲基合成而得，具有顯著的抗癌活性，其毒副反應較低，也是目前惟一具有升高白細胞作用的抗腫瘤藥物，對常見腫瘤細胞的生長有抑制作用。本實驗通過貼骨接種NCI-H446細胞制作骨轉移裸鼠模型，檢測其X線、生化及物理指標，并進行病理學分析，探討去甲斑蝥素對肺癌骨轉移抑制作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及材料 人小細胞肺癌細胞株NCI-H446(批號20100716)由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。完全RPMI-1640培養(yǎng)基(由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供)，超級新生牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供。

小鼠I型前膠原C端肽(PICP)ELISA試劑盒、小鼠I型前膠原N端肽(PINP)ELISA試劑盒、小鼠骨涎蛋白(BSP)ELISA試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。去甲斑蝥素鈉(批號100701)由吉林一心制藥股份有限公司提供。麻醉藥物使用注射用鹽酸氯胺酮(2ml∶0.1g)，硫酸阿托品(2ml∶1mg)，鹽酸異丙嗪(2ml∶50mg)各1支，混勻。接種用注射針為美國B-D公司醫(yī)用51/2號針。

1.1.2 主要儀器 X線機為日本TOSHIBA KXO-8ON，顯微鏡為日本Nikon Eclipse E600，層流架為江蘇省蘇州市吳縣實驗動物設施設備廠生產(chǎn)的SEL-1型。全自動酶標儀(Thermo MULTISKAN MK3，450nm、630nm)由芬蘭Thermo absystems公司提供。

1.1.3 實驗動物 由上海腫瘤研究所實驗動物中心提供5周齡BALB/c-nu/nu雄性裸鼠(約20g/只)，按SPF級標準飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學院實驗動物中心層流架內。

1.2 H446細胞骨轉移動物模型的制作

細胞培養(yǎng)NCI-H446細胞株用含10%小牛血清、80U·ml-1青霉素、0.08mg·ml-1鏈霉素的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h更換新鮮培養(yǎng)基1次。取指數(shù)生長期的H446細胞，經(jīng)消化后，用無血清培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×107個/ml。無菌條件下，實驗組每只5周齡裸鼠于右后肢脛骨處肌肉下貼骨接種200μl細胞懸液(含2×106個細胞)。裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于層流架內，每周1～2次觀察裸鼠生存狀態(tài)及接種部位腫瘤生長情況。每周于固定時間檢測小鼠體重，并觀察腫瘤生長情況，按體重調整藥量。

1.3 H446細胞骨轉移動物模型的鑒定

X線攝片 細胞接種后2周及7周，取模型裸鼠腹腔注射氯胺酮50mg/kg麻醉，取其俯臥位行X線攝片(10mA，88kV，0.04s，靶片距為100cm)。

1.4 去甲斑蝥素對肺癌細胞骨轉移的干預研究

實驗10d后以腫瘤長徑大于4mm為造模成功，63只實驗裸鼠中有60只達造模標準，造模成功率為95%。將60只模型鼠隨機分成3組，即對照組、低劑量藥物組、高劑量藥物組。對照組每天以100μl生理鹽水灌胃。藥物組應用制備的斑蝥提取液(無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的去甲斑蝥素鈉溶液，終濃度為10μg/ml)進行灌胃，每日1次連續(xù)30d。低劑量藥物組為102.4mg/kg。高劑量藥物組為250mg/kg。

1.5 H446細胞骨轉移動物模型生化特性的檢測

在肺癌細胞H446接種后10d，將裸鼠麻醉，暴露腹部，下腔靜脈取血，應用小鼠ELISA試劑盒及酶標儀檢測血清PICP、BSP、PINP指標。接種7周后處死裸鼠，同時取血檢測上述生化指標。

1.6 H446細胞骨轉移動物骨破壞的病理分析

接種7周后處死裸鼠，分別取各裸鼠的右后肢，置于用10mmol/L PBS(pH7.2)配制的10%福爾馬林中，固定72h。用水沖洗干凈后，浸泡于14%ED-TA液中，脫鈣處理2周。其間每隔1d更換EDTA液，并用搖床振蕩。脫鈣結束，流水沖洗2h，對標本行常規(guī)病理分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

實驗觀察各組小鼠一般狀況良好，外觀、大便均正常，未見毒副反應。

2.1 肺癌細胞骨轉移的發(fā)生及鑒定

在肺癌細胞H446接種后10d，肉眼可觀察到裸鼠的右后肢接種處生長出實體瘤，呈不規(guī)則形狀，并隨時間的延長逐漸突出增大，至一個月時已開始影響右后肢的活動功能。接種后2周經(jīng)X線攝片檢查發(fā)現(xiàn)，與自體左右肢脛骨比較，右后肢脛骨表面開始模糊，證明損傷。至7周時脛骨已接近溶斷(見圖)。接種8周后處死裸鼠，裸鼠右后肢經(jīng)固定、脫鈣等處理后，HE染色分析對腫瘤致骨損傷的影響。結果由圖表明，H446肺癌細胞引起接種局部明顯的骨破壞，部分嚴重者甚至已沒有明顯的骨組織存在，原有的骨組織被破壞后，在其周圍有廣泛的反應性骨生成，而骨髓中發(fā)現(xiàn)已有多處腫瘤細胞侵入。

2.2 去甲斑蝥素對肺癌細胞骨轉移的干預

2.2.1 荷瘤小鼠腫瘤大小及重量比較 低劑量藥物組腫瘤質量(0.985±0.167)g，體積(273.07±98.70)cm3;高劑量藥物組腫瘤質量(0.739±0.153)g，體積(248.11±101.06)cm3;對照組腫瘤質量(1.129±0.188)g，體積(723.18±195.24)cm3。與用藥組比較，對照組腫瘤生長快，質量、體積大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2.2 3組小鼠體重的變化 每周于固定時間檢測小鼠體重。與用藥組比較，對照組小鼠體重增長明顯緩慢，實驗結束時低劑量藥物組、高劑量藥物組與對照組體重增長總量分別為(6.19±1.05)、(5.84±1.26)、(3.46±0.76)g，對照組顯著低于用藥組(P＜0.01)，而低劑量藥物組與高劑量藥物組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2.3 X片檢查結果 在X片證實有腫瘤性骨損傷發(fā)生后，給予裸鼠去甲斑蝥素藥物干預。其經(jīng)X片檢查顯示，干預3周后，藥物組裸鼠右后肢脛骨骨損傷病程與模型對照組相比被明顯抑制，至接種后7周時，差異更加顯著(見圖示)。

2.2.4 血清PICP、BSP、PINP的檢測 3組分別接種肺癌細胞H446后10d、7周檢測血清PICP、PINP、BSP水平。結果發(fā)現(xiàn)各組骨轉移早期PICP、PINP水平均明顯升高，其中對照組骨轉移晚期較早期PICP、PINP水平均明顯升高(P＜0.01);低劑量藥物組PICP水平明顯升高(P＜0.01)、PINP水平略有增高(P＜0.05);高劑量藥物組放射學檢查顯示晚期腫瘤性骨損傷組血清PICP、PINP水平升高均不明顯(P＜0.05)，各組血清 BSP水平均升高(P＞0.05)。提示血清PICP、PINP水平升高對早期骨轉移具診斷價值，對骨轉移藥物療效監(jiān)測有重要臨床參考意義。

3 討論

在世界范圍內，無論是男性還是女性，肺癌已成為癌癥死亡的主要原因［1］。近年來，隨著我國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，城鄉(xiāng)居民健康行為和疾病模式也發(fā)生了變化，惡性腫瘤死亡率居于世界較高水平，肺癌成為首位惡性腫瘤死因，30年來發(fā)病率勁升超過4倍。骨轉移瘤是原發(fā)于其他臟器的惡性腫瘤經(jīng)血運或其他途徑轉移到骨骼的腫瘤，是常見的腫瘤并發(fā)癥之一。近年來，隨著癌癥發(fā)病率上升，骨轉移瘤的發(fā)生率也逐年上升。約70%～80%的腫瘤可以發(fā)生骨轉移，多數(shù)轉移瘤的生物學行為表現(xiàn)比原發(fā)瘤更差，其生長速度更快［2］。肺癌是親骨性腫瘤之一，所以極易發(fā)生骨轉移，多宗報道肺癌骨轉移發(fā)生率為30% ～40%，尸檢發(fā)現(xiàn)肺癌骨轉移發(fā)生率為44%［3］。在肺癌初次診斷時確定有骨轉移者最多為腺癌，其次為小細胞肺癌和鱗癌。

骨轉移瘤是一種腫瘤發(fā)生骨轉移時腫瘤已經(jīng)進展至晚期，所以治療原則是緩解疼痛、預防和治療病理性骨折，改善患者生活質量，延長生存期。骨轉移臨床治療也相當棘手，西醫(yī)主要采取手術、放化療、內照射治療、骨吸收抑制劑和內分泌等治療，近期有一定療效，但是毒副反應大，遠期療效不佳，因此常常需要以中藥為主的輔助治療來改善患者的生活質量。對那些體質狀況差、不能耐受或者不愿意接受手術、放化療的患者，則應采用以中醫(yī)藥辨證治療為主的綜合治療方案。近年來中醫(yī)藥在骨轉移瘤的治療中取得了較大的進展，積累了一些較好的經(jīng)驗。目前中醫(yī)藥已經(jīng)廣泛應用于各類骨轉移瘤的治療，包括辨證施治、專方專藥、外用藥止痛及配合現(xiàn)代醫(yī)學等多種治療方法，均取得滿意療效。中醫(yī)藥防治該病的優(yōu)勢在于既可止痛，又可抗癌，并能增強免疫及促進骨髓造血功能，提高抗病能力，減少放化療的毒副反應，明顯改善晚期患者的生存質量。但是臨床上有關中藥治療腫瘤骨轉移的實驗研究的報道很少［4］。

研究表明，斑蝥素能抑制腫瘤細胞的蛋白質合成，繼而影響RNA和DNA的合成及細胞周期的進程［5］，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。斑蝥素還具有較強的抗腫瘤細胞侵襲和轉移的作用［6］。去甲斑蝥素是由呋喃及順丁烯二酸酐通過Diles-Alder加成反應后經(jīng)催化加氫合成制得。去甲斑蝥素的作用和斑蝥素相似，也可抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡，并具有抗腫瘤細胞侵襲和轉移的能力。去甲斑蝥素對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用［7～13］，是一種新型的抗腫瘤中藥，并且具有獨特的升白細胞功能［14］，是國際上第一個有升高白細胞作用的抗癌藥物［15］，主要用于治療肝癌、食管癌和胃癌，但是去甲斑蝥素對骨轉移癌的實驗研究國內外均未見報道。本實驗從病理、影像學及生化水平等幾個方面充分證明了去甲斑蝥素對腫瘤生長的抑制作用，并得出高劑量去甲斑蝥素對腫瘤體積增大、骨破壞進展的抑制作用明顯好于低劑量組的結論，但此觀點需臨床進一步觀察證實。

目前診斷骨轉移最直接的方法是骨活檢，但該法為有創(chuàng)操作，患者大多難以接受，不能短時間內多次進行。X線、ECT、CT和MRI檢查是診斷骨轉移的常用手段。X線敏感性低，當骨轉移灶直徑≥1～2cm、局部脫鈣量達30% ～50%時，X線才能發(fā)現(xiàn)骨小梁的破壞性病變。ECT可早于X線檢查3～6個月發(fā)現(xiàn)骨損害，但特異性低，且存在反跳現(xiàn)象，短時間內不能區(qū)分是治療有效還是骨轉移進展。CT、MRI適合骨掃描陽性而X線陰性的患者明確病變［16］。上述檢查費用高、需要時間積累、有輻射危害等限制，不便于經(jīng)常性地監(jiān)測骨代謝的動態(tài)變化。隨著對腫瘤性骨病發(fā)病機制研究的不斷深入，應用某些骨代謝指標微觀性地評價骨損害的程度，可判斷骨轉移的病情變化是否有臨床實際意義。血清骨代謝生化指標PICP、PINP的檢測對骨轉移的診斷意義臨床報道較少，對其在早期診斷的價值研究國內尚未見相關報道，本研究為臨床早期診斷骨轉移提供了較好的理論基礎，實驗同時驗證了血清PICP、PINP水平對抗骨轉移藥物療效監(jiān)測的重要作用。

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