喉癌患者治療前后外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達及臨床意義

孟慶翔 謝景華 高雄輝 李 明 王 磊 李 鵬

喉癌是頭頸部常見的上皮源性惡性腫瘤，目前臨床治療以根治性手術結合術前或術后輔助性放療為主，但療效評價缺乏客觀、敏感、特異的檢測指標。喉癌致死的主要原因是復發和轉移，而上皮性腫瘤在侵襲和轉移的早期階段就可能有癌細胞入侵，進入血液的癌細胞可表達多種上皮性特異性蛋白。巢式RTPCR可在1×107個單核細胞中檢出1～10個腫瘤細胞，敏感性、特異性遠遠高于其他方法［1］。本研究通過巢式RT-PCR法檢測喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA臨床治療前后的表達情況，結合臨床資料綜合分析，以期為喉癌局部復發的預測、指導臨床治療提供依據。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2006年1月至2007年12月我院收治的喉癌患者48例，均為男性，年齡44～79歲，中位年齡56歲。48例患者中:聲門型34例，聲門上型14例;T1N0M012例，T2N0M09例，T3N0M012例，T3N1M08例，T4N0M02例，T4N1M05例。臨床分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期27例，術前臨床診斷淋巴結轉移13例。所有病例術前經病理確診為鱗狀細胞癌。

1.2 治療方案

48例患者全部接受手術治療，其中喉部分切除21例，全喉切除27例，行頸淋巴結清掃14例，術后行輔助性放療19例，放療計量50Gy。分別于術前和術后6、12、24個月抽取患者外周靜脈血。另抽取10例聲帶息肉患者為陰性對照，10例喉癌組織為陽性對照。

1.3 隨訪結果

術后隨訪24個月，其中1例Ⅳ期患者術后24個月失訪。4例復發:頸部淋巴結復發3例(術后13、18和21個月，均為Ⅳ期);氣管造漏口周圍復發1例(術后21個月，Ⅳ期)，所有局部復發病例都經病理證實并接受進一步治療，無死亡病例。

1.4 主要試劑

淋巴細胞分離液、Trizol、逆轉錄試劑盒、Taq酶、DEPC(上海生工生物工程公司)、Taq、dNTP(美國MBI公司)、DNaseⅠ、RNase(大連寶生物技術有限公司)、水飽和酚、氯仿、異丙醇均為國產分析純，實驗室試劑以無菌去離子水配制，用于RNA提取試劑及器皿均以0.05%DEPC處理;引物設計參照文獻［2～4］，引物由上海申友生物公司合成，引物序列為:CK19-A: 5'-GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3';CK19-B:5'-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG-3'CK19-C:5'-CGAGCAGAACCGGAA-3';CK19-D:5'-TGAGCCGCTGGTACTCCTGAT-3';CK20-A:5'-CAGACACACGGTGAACTATGG-3';CK20-B:5'-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3';CK20-C:5'-CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG-3';CK20-D:5'-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3';β-actin同義鏈:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3';βactin 反義鏈:5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'。

1.5 方法

1.5.1 總RNA提取 取患者術前外周靜脈血3～5ml，枸櫞酸鈉抗凝，2h分離外周血單個核細胞(the peripheral blood mononuclear cells，PBMNC);腫瘤組織以勻漿器研碎得細胞懸液。一步法(Trizol)提取細胞和組織的總RNA，-80℃保存待用(無RNA酶的DNaseⅠ去除混雜的DNA)。取5μl總RNA電泳觀察28S和18S亮帶，鑒定RNA提取質量，分光光度計定量。以OD260/OD280為1.7～2.0及電泳帶28S∶18S約2∶1，表明所提取的RNA符合要求。

1.5.2 取1～2μg細胞總 RNA，70℃ 6min變性后，根據Takara RNA試劑盒進行cDNA第1鏈合成。各取5μl逆轉錄產物行第1輪PCR，第1輪PCR反應產物 0.5μl行第 2輪 PCR，另有 10×PCR Buffer、dNTP及MgCl2等，反應總體積均為25μl。CK19擴增的第1輪PCR引物為A和B，反應條件:94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循環40 次;第2輪引物為 C和 D，退火溫度為52℃，余同第1輪。CK20擴增的第1輪PCR引物為A和B，反應條件:94℃變性 30s，63℃退火 1min，72℃延伸 30s，循環 35次;第2輪引物為C和D，退火溫度為62℃，余同第1輪。β-actin循環條件為 95℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循環 35 次，72℃延伸 10min。

1.5.3 結果觀察 取5μl第2輪PCR產物以1.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在1×TBE緩沖液里，100V，30min。紫外燈下觀察并拍照，在 303、319、及531 bp處出現肉眼可見條帶判為陽性。

1.6 統計分析

用SPSS 11.0軟件包分析各組數據，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法對病例數據進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者外周血組、陽性對照組與陰性對照組CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達情況

48例喉癌患者外周血CK19 mRNA陽性18例，CK20 mRNA陽性22例，兩者均陽性11例，兩者均陰性者8例。10例喉癌組織CK19 mRNA陽性10例，CK20 mRNA陽性9例。10例陰性對照CK19 mRNA陽性1例;CK20 mRNA陽性0例。實驗組及對照組β-actin均表達。外周血組及陽性對照組與陰性對照組比較，陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治療前后的表達情況

喉癌患者(除隨訪24個月內1例失訪，4例復發)術前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達顯著高于術后6、12、24個月，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治療前后的表達情況

2.3 術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達與喉癌復發的關系

47例患者(1例失訪)根據術后24個月內腫瘤局部復發與否分為復發組與無復發組。復發組術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達均為75%(3/4)，無復發組術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達分別為34.5%(15/43)和44.2%(19/43)，復發組術前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達高于無復發組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。復發組術后6、12個月外周血 CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達與術前比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 喉癌患者復發組與無復發組術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達情況

3 討論

癌細胞在外周血中的微轉移是腫瘤復發和轉移的重要起始步驟。喉癌屬上皮源性惡性腫瘤，其復發與轉移是影響其遠期療效的重要因素。細胞角蛋白(cytokeratins，CKs)在正常上皮、上皮源性腫瘤及其轉移性腫瘤細胞中均有表達，正常情況下如果外周血中檢測出CK，提示上皮源性腫瘤細胞已轉移入血，并且存活為循環腫瘤細胞。CK20、CK19是國內外公認的、最常見的上皮性組織特異性標志物。被廣泛應用于乳腺癌、胃腸癌、肺癌及食管癌等上皮性惡性腫瘤淋巴結、骨髓以及外周血中微轉移的檢測［5～8］，顯示了較好的敏感性和特異性。

李平棟等［9］研究認為CK19 mRNA可作為腫瘤標志物對喉癌和下咽癌的復發及遠處轉移的早期診斷提供幫助。我們前期研究已發現［10］:喉癌患者術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA陽性表達與腫瘤的細胞分化程度無相關性，與喉癌的分型(原發部位)、T分期、臨床分期及淋巴結轉移的發生有相關性。本研究選取術后6、12、24月作為外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA表達的檢測時間點，發現術后6、12、24月外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達均較術前顯著下降(P＜0.05)，表明根據喉癌的臨床分型、分期所采取的根治性治療方案對外周血微轉移具有明顯的抑制作用，且該抑制作用在術后24個月內是有效的，可為臨床治療的評價提供分子生物學水平上的依據。

在術后隨訪的24個月內，除外1例失訪，其余47例患者中共有4例出現腫瘤術后局部復發，占8.5%(4/47)，與 Jung等［7］對乳腺癌的研究結果一致。本研究中復發組術前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達高于無復發組(P＜0.05)，提示喉癌患者術前外周血微轉移增加了腫瘤局部復發的機會。進一步分析復發患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達情況，結果表明，術前和術后6、12月外周血微轉移差異無統計學意義(P＞0.05)，說明根治性治療方案仍不能降低部分患者的外周血微轉移的發生率，尤其是術前外周血CK19 mRNA與CK20 mRNA的陽性表達者和術后上述指標持續陽性表達者。這與Chen等［11］對肺癌的研究結果相一致。但是由于本組48例喉癌患者術后24個月內僅有4例局部復發，病例數較少，上述結論有待大樣本資料的進一步研究證實。對于10例陰性對照中出現的1例CK19 mRNA陽性表達，不排除在靜脈采血過程中的采血針頭被上皮源性組織的污染，從而產生的假陰性表達。

［1］ Fidler IJ.7thJan Waldenstromlecture.The biology of human cancer mastatis［J］.Acta Oncol，1991，30(6)∶669-675.

［2］ Gerhard M，Juhl H，Kalthoff H.Specific detection of carcinoembryonic antigenexpressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction［J］.J Clin Oncol，1994，12(4)∶725-729.

［3］ Schoenfeld A，Luqmani Y，Smith D，et al.Detection of reast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction［J］.Cancer Res，1994，54(11)∶2986-2990.

［4］ Funaki NO，Tanaka J，Ohshio H.et al.Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients［J］.Br J Cancer，1998，77(8)∶1327-1332.

［5］ Jung YS，Lee KJ，Kim HJ，et al.Clinical significance of bone marrow micrometastasis detected by nested rt-PCR for keratin-19 in breast cancer patients［J］.Jpn J Clin Oncol，2003，33∶167-172.

［6］ 鄔宇飛，夏加增，李 輝，等.胃腸道癌患者外周血和骨髓中微轉移檢測的意義［J］.中國腫瘤臨床，2002，29(7)∶489-491.

［7］ Yamashita J，Matsuo A，Kumsu Y，et al.Preoperative evidence of circulating tumor cellls by means of reverse transcriptase-polymerise chain reaction for carcinoembryonic antigen messenger RNA is an independent predictor of survival in non-small cell lung cancer:a prospective study［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2002，124∶299-305.

［8］ 王景美，杜 艷，郭 英，等.食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表達及其臨床病理意義［J］.東南大學學報，2006，25(6)∶414-441.

［9］ 李平棟，于振坤，黃志剛，等.喉、喉咽癌患者外周血播散腫瘤細胞檢測的初步研究［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13(4)∶215-218.

［10］ 孟慶翔，謝景華，高雄輝，等.喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達［J］.中國熱帶醫學，2009，9(9)∶1708-1710.

［11］ Chen TF，Jiang GL，Fu XL，et al.Prognostic Significance of CK19 mRNA Expression Measured by Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)in Peripheral Blood of Patients with Non Small Cell Lung Cancers Treated by Chemo-radiation ［J］.1nt J RadiatOncol Biol Phvs，2004，60(Sunn1)∶237.