病理性瘢痕與正常皮膚的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

胡志成，朱家源，朱 斌，郭 棟，2，陳 斌，張 凱，胡坤華，黎明濤，唐 冰△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷外科，廣東 廣州 510080;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510630;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

病理性瘢痕主要包括瘢痕疙瘩(keloid)和增生性瘢痕(hypertrophic scar)，是人體對(duì)創(chuàng)傷產(chǎn)生過度愈合反應(yīng)的結(jié)果，它們都以成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)過度增生、分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)、導(dǎo)致膠原的過量合成和沉積為特征，其確切的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚[1，2]。蛋白質(zhì)作為發(fā)揮基因功能的載體，是生命功能的真正執(zhí)行者。為此，如果尋找出疾病高敏感性和特異性的差異蛋白質(zhì)，則可以對(duì)揭示病理性瘢痕形成機(jī)制提供新的思路。因此，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮膚進(jìn)行差異蛋白表達(dá)的研究，建立病理性瘢痕和正常皮膚組織的雙向凝膠電泳圖譜，初步篩選出病理性瘢痕相關(guān)的功能性蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步揭示病理性瘢痕的形成機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供線索和依據(jù)。

材料和方法

1 臨床資料

標(biāo)本來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷外科2010年1月－2010年6月手術(shù)切除的組織。瘢痕疙瘩8例，男、女各4例，年齡17－32歲;增生性瘢痕8例，男、女各4例，年齡21－38歲。病理性瘢痕的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[3]，經(jīng)臨床及病理診斷證實(shí)，且患者于手術(shù)前未進(jìn)行放療、激素或者其它治療;正常對(duì)照皮膚3例，取自整形外科患者軀干皮膚，男性2例，女性1例，年齡22－32歲。所有的組織經(jīng)液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊呔炇鹬橥鈺?/p>

2 材料和儀器

冰醋酸、丁醇為Merck產(chǎn)品;尿素、Tris堿、3－[3－(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽、二硫蘇糖醇、溴酚藍(lán)、甘油、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、IPG strip、IPG buffer、蛋白質(zhì)純化試劑盒、定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)均購自Amersham Biosciences;硫脲、除高峰度蛋白試劑盒為Sigma產(chǎn)品。DU530型核酸/蛋白分析儀(Beckman);IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT six大型垂直電泳系統(tǒng)、掃描儀ImageScanner和Lab-Scan軟件(Amersham Biosciences);質(zhì)譜儀Ultraflex III(Bruker);AF100型制冰機(jī)(Scotsman);Belly Dancer多維軌道搖床(Stovall);Mini Spin Plus小型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf);排風(fēng)柜(Fisher)。

3 方法

3.1 組織提取蛋白 稱取200 mg的組織物，在蔗糖中充分剪碎，點(diǎn)動(dòng)離心，加入裂解液勻漿后超聲波處理，20000×g離心30 min，取中間層液體。按蛋白質(zhì)純化試劑盒說明書方法純化蛋白后，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。

3.2 雙向凝膠電泳(2D－DIGE) 將蛋白樣品進(jìn)行第一向電泳。IEF參數(shù)設(shè)置為:30 V、12 h(膠條再水化);500 V、1 h;1000 V、1 h;8000 V、30 min;10000 V、10 h;500V、12 h;85000 VHr收膠。IEF 結(jié)束后，在平衡緩沖液中平衡膠條。將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%濃度的SDS－PAGE膠面上行第二向電泳，參數(shù)設(shè)置為:2W/gel、12W，50 min 后改為 17 W/gel、100 W;直至膠內(nèi)電泳指示劑溴酚藍(lán)跑出凝膠下緣10 min。對(duì)凝膠按Deep Qurple說明書方法進(jìn)行熒光染色。

3.3 圖像采集與分析 使用 Typhoon 9400型多功能激光掃描儀對(duì)凝膠成像，用ImageQuant圖像分析軟件進(jìn)行圖譜分析。凝膠圖像經(jīng)識(shí)別、分析后，尋找差異點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析使用Student's t－test法。選取蛋白斑點(diǎn)豐度差異大于4倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)、t－test P＜0.05的斑點(diǎn)作進(jìn)一步分析。

3.4 質(zhì)譜圖的獲取 用Spot Handling Workstation對(duì)染色的凝膠處理，取AnchorChip靶點(diǎn)樣后在質(zhì)譜上進(jìn)行MALDI－TOF/TOF分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)和利用LIFT軟件將對(duì)4個(gè)強(qiáng)度最大峰肽段進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析。

3.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析 使用Biotools軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，參數(shù)設(shè)置為:檢索種屬為human;數(shù)據(jù)檢索的方式為combined;最大允許漏切位點(diǎn)為1;酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置:PMF 50 ppm，MS/MS 0.5 Da。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩組間差異蛋白的比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為 0.05。

結(jié) 果

1 雙向電泳和圖譜比較

對(duì)瘢痕疙瘩組織、增生性瘢痕組織和正常皮膚組織同時(shí)進(jìn)行2D－DIGE分離，在相同條件下分別重復(fù)4次，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩組織、增生性瘢痕組織和正常皮膚組織凝膠電泳圖譜中平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為2978、2975和3053，將其中1塊膠設(shè)定為參考膠，進(jìn)行6個(gè)凝膠圖譜斑點(diǎn)的匹配分析得到平均匹配率分別為76%、69%和78%，發(fā)現(xiàn)其在凝膠圖譜中的位置上均有較好的重復(fù)性。根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量與所有匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量總和的比值＞4，且同組4塊膠圖譜中都出現(xiàn)相同變化的蛋白點(diǎn)，被認(rèn)為是差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，見圖1。

2 質(zhì)譜分析結(jié)果和蛋白質(zhì)鑒定

在瘢痕疙瘩組織、增生性瘢痕組織和正常皮膚組織的2D－DIGE圖譜中，選取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行MALDI－TOF/TOF質(zhì)譜分析，得到蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖(peptide mass fingerprint，PMF)后，應(yīng)用PMF數(shù)據(jù)，通過Biotools查詢軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的比較來鑒定蛋白質(zhì)。

2.1 瘢痕疙瘩與增生性瘢痕一致性分析 病理性瘢痕與正常皮膚組織相比，經(jīng)質(zhì)譜分析共鑒定出36種不同蛋白，其中，瘢痕疙瘩有27種(圖1A)，而增生性瘢痕有25種(圖1B);有16種蛋白同時(shí)表達(dá)在瘢痕疙瘩與增生性瘢痕中，包括上調(diào)蛋白8種，下調(diào)蛋白8種，見表1。

Figure1.2－D DIGE image of pathological scars，the up and down－regulated protein spots were marked.A:2－D DIGE image of keloid;B:2 －D DIGE image of hypertrophic scars.圖1 病理性瘢痕雙向差異凝膠電泳圖

表1 瘢痕疙瘩和增生性瘢痕發(fā)生一致變化的差異表達(dá)蛋白Table1.List of consistently differentially－expressed proteins in both keloid and hypertrophic scar compared with normal skin

2.2 瘢痕疙瘩與增生性瘢痕不一致性分析

①在瘢痕疙瘩中差異表達(dá)而增生性瘢痕中無差異表達(dá)變化的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出11個(gè)不同蛋白，其中上調(diào)9個(gè)，下調(diào)2個(gè)，見表2。

表2 瘢痕疙瘩中特異性差異表達(dá)的基因Table2.Specific and differentially－expressed proteins in keloid but not in hypertrophic scar

②在增生性瘢痕中差異表達(dá)而瘢痕疙瘩中無差異表達(dá)變化的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出9個(gè)不同蛋白，其中上調(diào)4個(gè)，下調(diào)5個(gè)，見表3。

表3 增生性瘢痕中特異性差異表達(dá)的蛋白Table3.Specific and differentially－expressed proteins in hypertrophic scar but not in keloid

討 論

瘢痕組織是人體創(chuàng)傷修復(fù)過程中的一種自然產(chǎn)物，其過度增生所形成的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是燒傷、整形外科最常見的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前也仍然缺乏理想的防治方法。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)8組瘢痕疙瘩、8組增生性瘢痕和3組正常皮膚組織進(jìn)行蛋白組學(xué)技術(shù)研究，成功建立了重復(fù)性較好的瘢痕疙瘩、增生性瘢痕與正常皮膚組織的雙向凝膠電泳圖譜。比較分析蛋白質(zhì)表達(dá)譜后，對(duì)表達(dá)差異超過4倍的斑點(diǎn)進(jìn)行了MALDI－TOF/TOF質(zhì)譜[4]分析，建立其肽質(zhì)量指紋圖并對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定，獲得了36個(gè)與病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表達(dá)一致的蛋白16個(gè)，其中上調(diào)蛋白8個(gè)，下調(diào)蛋白8個(gè);只在瘢痕疙瘩中表達(dá)的差異蛋白11個(gè)，其中上調(diào)9個(gè)，下調(diào)2個(gè);只在增生性瘢痕中表達(dá)的差異蛋白9個(gè)，其中上調(diào)4個(gè)，下調(diào)5個(gè)。對(duì)這些異常表達(dá)的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的研究，將可能為揭示病理性瘢痕形成機(jī)制提供新的思路。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中asporin均高表達(dá)。Asporin屬于富含亮氨酸重復(fù)序列的小分子蛋白多糖(small leucine－rich repeat，SLRP)家族，組成皮膚細(xì)胞外基質(zhì)。SLRPs是一組結(jié)構(gòu)及功能相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)分子，作為細(xì)胞生存的大分子環(huán)境，它們?cè)诩?xì)胞遷移、生長(zhǎng)、分化，組織修復(fù)和腫瘤生長(zhǎng)過程中起著重要作用。目前已證實(shí)asporin可與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF－β)形成功能性反饋環(huán):asporin可通過與TGF－β結(jié)合，阻礙TGF－β與TGF－βⅡ型受體相互作用，從而抑制TGF－β信號(hào)通路;同時(shí)，TGF－β可通過Smads信號(hào)通路間接地誘導(dǎo)asporin表達(dá)[5]。目前已知TGF－β/Smads信號(hào)通路與瘢痕的形成有著密切的關(guān)系[6]。所以，我們推測(cè)asporin可能在病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。在未來的研究中，我們將會(huì)對(duì)其作進(jìn)一步的研究，以確定其在瘢痕形成中的具體作用。

Osteoglycin為細(xì)胞外基質(zhì)分子，也隸屬富含亮氨酸小分子蛋白多糖基因家族(small leucine－rich proteoglycan，SLRP)成員[7]。目前研究表明，作為 SLRPs成員之一，osteoglycin可能抑制了膠原纖維的形成[8]。Tasheva 等[9]發(fā)現(xiàn) osteoglycin 基因敲除小鼠的角膜及皮下膠原纖維層較正常小鼠顯著增厚，主要是由于膠原代謝障礙引起。有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)，急性肺栓塞后肺組織內(nèi)osteoglycin mRNA和蛋白水平均逐漸降低，認(rèn)為osteoglycin的表達(dá)下降導(dǎo)致了Ⅰ型膠原的降解減少，從而引起Ⅰ型膠原在肺間質(zhì)堆積，形成肺間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)。本研究中發(fā)現(xiàn)osteoglycin在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中均呈低表達(dá)，這可能是導(dǎo)致病理性瘢痕膠原沉積，纖維增生的主要因素之一。其具體作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

波形蛋白(vimentin)是中等纖維的主要成分之一，在成纖維細(xì)胞中起到細(xì)胞支架與網(wǎng)絡(luò)的作用。研究發(fā)現(xiàn)波形蛋白的表達(dá)與瘢痕的形成與發(fā)展過程基本相同，而高表達(dá)的波形蛋白在瘢痕增生形成和攣縮中起到關(guān)鍵的作用[11]。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)增生性瘢痕的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與增生性瘢痕的形成和收縮有關(guān)，其中波形蛋白的基因呈高表達(dá)[12]。大量資料也表明:vimentin在人類許多上皮性腫瘤如腎癌、甲狀腺、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等異常表達(dá)，認(rèn)為與腫瘤的局部侵潤(rùn)侵蝕相關(guān)[13]，這可能與瘢痕疙瘩類腫瘤特性有關(guān)。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，vimentin在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中都呈高表達(dá)。在未來的工作中，我們也將對(duì)其具體的分子生物學(xué)意義做進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)成功建立病理性瘢痕和正常皮膚組織的雙向凝膠電泳圖譜，鑒定出差異蛋白36個(gè)，其中瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表達(dá)相同的蛋白16個(gè)，只在瘢痕疙瘩中差異表達(dá)蛋白11個(gè)，只在增生性瘢痕中差異表達(dá)蛋白9個(gè)。這些異常表達(dá)的蛋白在病理性瘢痕形成中可能起著重要的作用。而對(duì)其功能的深入研究，則有可能為闡明病理性瘢痕的形成機(jī)制提供新的方向，并為其治療提供新的治療靶點(diǎn)。

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