抵抗素基因多態性與中國東北地區漢族老年人群2型糖尿病患病的相關性

孫亞東 馬 彥 楊 樂 (吉林省人民醫院內分泌科，吉林 長春 130021)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)主要與胰島素抵抗和胰島β細胞分泌胰島素的功能受損有關。抵抗素作為一種新發現的脂肪組織分泌的肽類激素，成為近年來的研究熱點，其功能是對抗胰島素作用，導致機體胰島素抵抗。抵抗素的表達受多種因素的調節，如年齡、性別、營養狀態、激素、局部因子及藥物等〔1〕。因此本文對抵抗素基因在中國東北地區老年T2DM患者中進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)進行檢測，探討中國東北地區漢族老年人群中抵抗素基因的多態性與T2DM的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有研究對象均來自于我院內分泌科2009年3月至11月住院患者及體檢中心健康體檢者，均為中國東北漢族地區老年人群。T2DM組:115例(男59例，女56例)，年齡60～71〔平均(64.28±6.77)〕歲，體重指數(23.1±2.81)kg/m2，診斷符合1999世界衛生組織(WHO)的診斷標準:空腹血糖(FPG)≥7.0 mmo1/L及/或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，均除外原發性心肺疾病、腦血管疾病、T2DM大血管并發癥以及微血管并發癥。正常對照組:99例(男51例，女48例)，年齡60～70〔平均(63.86±6.23)〕歲，均為本院體檢中心健康體檢者，追問病史、體檢、實驗室及心電圖檢查，排除糖尿病、腦血管疾病、心肺疾病及腎臟疾病等。所有入選者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先隨機選取其中20例T2DM患者DNA作為篩查SNP的樣本。

1.2 方法〔2〕所有入選者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先隨機選取其中20例T2DM患者DNA作為篩查SNP的樣本。

1.2.1 SNP檢測 聚合酶鏈反應(PCR)在96孔薄壁板中進行。PCR反應體系為25 μl，包含10 ng人基因組 DNA，10×PCR 緩沖液 2.5 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L 引物 0.4 μl/對，5 U/μl TagDNA 酶 0.2 μl。PCR儀為Prkin-Elmer-Cetus9700。PCR反應條件為酶激活95℃2 min，94℃變性40 s，退火溫度在起始的10個循環中為63℃ ～58℃，每次遞減0.5℃，反應60 s，延伸72℃ 35 s;在以后的30個循環中，退火溫度固定為58℃，每次反應為40 s，延伸72℃35 s;終末延伸72℃ 10 min。序列測定:PCR擴增的目的片段經電泳鑒定、resin(Wizard PCR Preps DNA purification Resin，Promega)純化后，用ABlPRIMERTM，Big-Dye末端標記試劑盒(PE，Foster City，CA)，以PCR反應的特異引物為測序引物進行雙向測序反應。測序反應條件:96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，35個循環。產物經乙醇沉淀，ABI377自動測序儀行核苷酸序列測定。并進一步用PolyPhred軟件對測序結果進行分析，綜合正反雙向序列結果識別SNP。

1.2.2 SNP的基因分型 對所篩查出的SNP采用直接測序法對所有受試者作進一步基因分型。

1.3 統計學方法 采用SAS軟件，計算兩組SNP位點的等位基因頻率，組間差異分析采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 抵抗素多態性分析 抵抗素基因共測序2 813 bp，共檢出5個SNPs，均在啟動子區。

2.2 SNP等位基因頻率在T2DM組與正常對照組比較 采用直接測序法在T2DM患者和99例正常對照者間作進一步基因分型，結果表明這些SNP的等位基因頻率在兩組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 抵抗素基因SNPs在T2DM組和正常對照組間等位基因頻率比較(%)

3 討論

T2DM患病率逐年提高，死亡率亦逐年增加，深入探索其發病機制對于糖尿病血管病變的綜合防治、提高糖尿病患者的生存率和生存質量有重要的理論和實踐意義。遺傳因素在其中可能起著相當重要的作用，故探討遺傳基因多態性與T2DM并發癥發生發展的關系成為近年研究熱門〔3～5〕。

抵抗素與胰島素抵抗、糖尿病、炎癥、動脈粥樣硬化(AS)等病理過程或疾病有關，但其具體作用還不很明確。人抵抗素基因定位于19p13.3，內含子邊界序列均高度保守。其mRNA含476個堿基，迄今僅發現2種人抵抗素亞型。最近研究表明，抵抗素蛋白晶體具有獨特的多聚體結構:每個單體尾端由二硫鍵相連，形成三聚體或四聚體結構，此二硫鍵形成可能是抵抗素活化的必需步驟之一。抵抗素二聚體具有全蛋白80% ～90%的功能，而抵抗素單體僅有全蛋白10% ～20%的功能。抵抗素的裝配與調節機制迄今尚不明確，推測可能對二硫鍵的剪切或裝配過程的調節來調節抵抗素的剪切與裝配〔6〕。

有研究發現糖尿病微血管病變患者與單純T2DM病患者的血漿抵抗素水平均顯著高于正常對照組〔7〕。而亦有研究認為血清抵抗素可能與T2DM的發病不相關〔2〕。本研究采用直接測序法在T2DM和正常對照組間進行基因分型及等位基因頻率比較，共檢測5個SNP，結果顯示在上述兩組東北地區漢族老年人群中這此SNP的等位基因頻率無顯著性差異，表明抵抗素基因多態性與東北地區漢族T2DM老年人群中無顯著相關性，這可能與研究樣本的數量、位點的選取及不同種族間的糖尿病易感性及個體差異有關。

本研究認為抵抗素基因多態性與中國東北地區漢族人群老年T2DM無顯著相關性。

1 孫 禎，李希圣.抵抗素與肥胖及2型糖尿病相關性研究〔J〕.醫學綜述，2009;15(11):1693-5.

2 董 艷，黃 微，李 果，等.抵抗素基因多態性與華東地區2型糖尿病的相關性〔J〕.上海第二醫科大學學報，2003;23(2):97-9.

3 Patel SD，Rajala MW，Rosseui L，et al.Disulfide-dependent multimeric assembly of resistin family hormones〔J〕.Science，2004;304(5674):1154-8.

4 Arita Y，Kihara S，Ouchi N，et al.Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cel〔J〕.Circulation，2002;105(24):2893-8.

5 Qi L，Doria A，Manson JE，et al.Adiponectin genetic variability，plasma adiponectin，and cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2006;55(5):1512-6.

6 徐偉斌，俞 璐，羅 敏.抵抗素的研究進展〔J〕.國際內分泌代謝雜志，2006;26(1):23-5.

7 莊 瑋，成興波.血漿抵抗素與2型糖尿病及糖尿病微血管病變關系的研究〔J〕.中國血液流變學雜志，2006;16(1):101-3.