TLR4在細菌性肺炎老齡大鼠多器官損傷中的表達及意義

李建生 王守富 張慧儉 秦金利 李素云 余海濱 王 峰 李 亞 劉四化

(河南中醫學院老年醫學研究所，河南 鄭州 450008)

Toll樣受體4(TLR4)是近年來逐漸明確的模式識別受體，主要介導內毒素(LPS)信號從細胞外至細胞內的跨膜轉導，體內外實驗表明其表達量與前炎癥因子釋放量直接相關〔1，2〕。過度炎癥反應則導致細胞組織損傷，引起臟器功能障礙或衰竭。而有關TLR4在老年多器官功能障礙綜合征(MODS)發病中所起作用研究較少，本實驗旨在進一步探討TLR4在老年感染性多器官損傷發病中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD老齡雄性大鼠(21月齡)，55只，體重(550±70)g;SD青年雄性大鼠(6月齡)，25只，體重(200±20)g，均由河南省實驗動物中心提供，合格證號:XK20050001。

1.1.2 試劑 肺炎克雷伯桿菌由中國生物制品檢驗鑒定所提供，種系號:K46114，使用前用無菌生理鹽水稀釋至1.2×1010cfu/ml。RT-PCR相關試劑:Trizol為Invitrogen公司提供，批號:1334257。RT-PCR一步法試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司提供，批號:BK3601。TLR4、脂多糖結合蛋白(LBP)、親免疫性蛋白(CD14)和白介素受體相關激酶(IRAK-1)mRNA及內參由上海博尚生物技術有限公司合成，訂單號:70714600，70614601。免疫組織化學抗體:TLR4和核轉移因子(NF-κB)單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，批號:BA1717和BA0610。瓊脂糖由英國OXOID LIMITED BASINGSTOKE提供，批號:889970-02。

1.2 方法

1.2.1 模型與分組 按李建生等〔3〕報道的方法復制大鼠多器官損傷模型。模型成功標準參照胡森等主編的《多器官功能障礙綜合征》提出的動物MODS時器官功能障礙分期診斷及評分標準〔4〕。老齡大鼠35只分為2組，老齡對照組10只、老齡模型組25只;青年大鼠25只分為2組，青年對照組10只、青年模型組為15只。造模48 h后處死動物。無菌留取動物肺、心、小腸組織進行TLR4信號通路相關分子基因表達檢測。

1.2.2 TLR4信號通路主要指標檢測

1.2.2.1 TLR4、LBP、CD14及IRAK-1 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR技術測定 TLR4、LBP、CD14及 IRAK mRNA表達。TLR4引物序列 (擴增片段長度為560 bp):5'-TCATCAGTGTATCGGTGGTC-3'(上游)，5'-TTTCATCTGGATTCAAGGCT-3'(下游)。LBP引物序列(擴增片段為789 bp):5'-CAAACTCTGCCAGTCACA-3'(上游)，5'-GGACATTGGCACCCAAGT-3'(下游)。CD14引物序列(擴增片段為468 bp):5'-GTTGCTGTTGCCTTTGAC-3'(上 游)，5'-AGCCAGGTATCCGTTCTT-3'(下游)。IRAK-1引物序列(擴增片段長度為243 bp):5'-CATGTGCCTACTGCCTGCTA-3'(上游)，5'-ACCCTGGGTGACTTGTGAAG-3'(下游)。3'-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)引物序列(擴增片段長度為309 bp):5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'(上游)，5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'(下游)。應用 Trizol試劑，提取肺、心、小腸組織總RNA，RNA經電泳證實28 S亞基為18 S亞基的2倍，且A260/A280≥1.8。按TaKaRa RT-PCR一步法試劑盒說明書配制RT-PCR反應體系。反應條件為:50℃逆轉錄反應 30 min，94℃預變性 3 min;94℃ 35 s，55℃ 35 s，72℃55 s，30個循環;72℃延伸7 min。取5 μl PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，采用Silver UVI proGA凝膠成像系統成像，進行半定量分析，通過目的基因與內參對照的積分光密度比值表示mRNA相對表達量。

1.2.2.2 TLR4、TRAF6和NF-κB活性檢測 采用免疫組織化學(SP)法檢測。免疫組化染色結果分析方法:光鏡下觀察，在400倍視野下，細胞膜、細胞漿呈棕色為免疫組化陽性。以光鏡觀察，用Image-Pro Plus 5.1專業圖像采集與分析系統采集圖像，并進行半定量分析。每張切片隨機選取不重疊的5個視野拍照，測定其平均光密度值及陽性細胞數，取其平均值代表各細胞因子的表達水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計分析軟件，計量資料用±s表示，各組間比較用單因素方差分析，不符合正態分布者進行數據轉化后比較。

2 結果

2.1 各組大鼠臟器組織LBP mRNA表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織LBP mRNA表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增強(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組肺、心組織表達又強于青年模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠臟器組織CD14 mRNA表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織CD14mRNA表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增強(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組肺、小腸組織則強于青年模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。2.3 各組大鼠臟器組織TLR4 mRNA表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TLR4 mRNA表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增強(均P＜0.01)。見表3。

表1 各組大鼠肺、心和小腸組織LBP mRNA的表達(x ± s，n=10)

表2 各組大鼠肺、心和小腸組織CD14 mRNA的表達(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠肺、心和小腸組織TLR4 mRNA表達變化(x ± s，n=10)

2.4 各組大鼠臟器組織TLR4蛋白表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TLR4蛋白表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增高(均P＜0.01)，老齡模型組肺、心組織TLR4光密度和小腸組織陽性細胞數則較青年模型組顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)。見表4。

2.5 各組大鼠臟器組織IRAK-1 mRNA表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織IRAK-1 mRNA表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增強(均P＜0.01)，老齡模型組心組織表達則強于青年模型組(均P＜0.05)，差異均有統計學意義。見表5。

表4 各組大鼠肺、心、小腸組織TLR4表達變化(± s，n=10)

組別 肺陽性細胞數 平均光密度心陽性細胞數 平均光密度小腸陽性細胞數 平均光密度青年對照組 19.50±16.51 0.340±0.047 18.00±13.62 0.246±0.010 7.29±6.98 0.230±0.167青年模型組 175.96±21.102) 0.442±0.03672)3) 194.56±22.102) 0.324±0.0232)4) 146.10±21.352)3) 0.568±0.2422)老齡對照組 29.25±21.194) 0.421±0.0354) 21.57±12.684) 0.284±0.0104) 17.33±13.674) 0.298±0.2884)老齡模型組 173.53±22.00 0.584±0.025 190.78±19.65 0.410±0.017 180.94±20.62 0.692±0.230

2.6 各組大鼠臟器組織TRAF6蛋白表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TRAF6蛋白表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增高(均P＜0.01)，老齡模型組心臟組織TRAF6陽性細胞數較青年模型組顯著增高(均P＜0.05)。見表6。

2.7 各組大鼠臟器組織NF-κB蛋白表達變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織NF-κB蛋白表達分別較老齡對照組和青年對照組明顯增高(P＜0.01或P＜0.05)，老齡模型組肺、心、小腸組織蛋白表達陽性細胞數和心組織積分光密度顯著高于青年模型組(均P＜0.01)。見表7。

表5 各組大鼠肺、心和小腸組織IRAK-1 mRNA表達變化(± s，n=10)

表5 各組大鼠肺、心和小腸組織IRAK-1 mRNA表達變化(± s，n=10)

組別 肺 心 小腸青年對照組0.476±0.256 0.347±0.208 0.405±0.293青年模型組 0.930±0.3442) 0.794±0.2292)3) 0.953±0.2422)老齡對照組 0.529±0.2784) 0.415±0.3434) 0.533±0.2174)老齡模型組1.071±0.225 1.176±0.259 1.008±0.198

表6 各組大鼠肺、心、小腸組織TRAF6表達變化( ± s，n=10)

表6 各組大鼠肺、心、小腸組織TRAF6表達變化( ± s，n=10)

組別 肺陽性細胞數 平均光密度心陽性細胞數 平均光密度小腸陽性細胞數 平均光密度青年對照組 23.32±22.66 0.350±0.080 9.43±9.07 0.192±0.036 11.29±9.52 0.205±0.016青年模型組 249.41±30.882) 0.575±0.0802) 187.53±12.722)3) 0.339±0.0382) 135.36±14.672) 0.293±0.0112)老齡對照組 30.00±24.044) 0.400±0.0854) 19.13±12.694) 0.207±0.0384) 23.16±15.014) 0.207±0.0144)老齡模型組 231.67±30.82 0.511±0.085 222.08±14.36 0.389±0.112 166.27±14.62 0.303±0.010

表7 各組大鼠肺、心、小腸組織NF-κB表達變化(x ± s，n=10)

3 討論

老年MODS的發病誘因以感染最為常見，引起感染致病菌主要是革蘭陰性菌，而革蘭陰性菌的主要致病因子是LPS。TLR4是LPS的跨膜受體，其信號轉導通路由主要LBP、CD14、TLR4、IRAK-1、TRAF6和NF-κB等相關分子組成，它介導了LPS誘導的機體炎癥反應。TLR4在老年MODS發病中變化規律和作用則需進一步明確。

肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，LPS為其主要致病因子，LPS需通過LBP而發揮致炎作用。LBP是一種由肝臟合成和分泌的血漿蛋白，LBP與LPS在炎癥反應急性期血清或單純LBP與LPS在體外混合后可以高親和力結合，借以將LPS傳遞給CD14，形成CD14-LPS復合體。LPS正是借助LBP的轉移、遞呈和催化作用而激活下游分子的〔5，6〕。本研究表明，模型組肺、心、小腸組織LBP、CD14 mRNA表達較對照組明顯增強，增強高的達5倍多;并且老齡模型肺、心組織LBP mRNA表達和肺、小腸組織CD14 mRNA表達又較青年模型增高顯著，提示LBP和CD14參與了感染性多器官損傷。LBP、CD14表達增強則進一步激活下游分子，介導炎癥反應。Bochkov〔7〕等應用氧化磷脂阻斷LPS、LBP和CD14，抑制了LPS誘導的NF-κB介導的炎癥基因表達上調。在注入LPS的小鼠，氧化磷脂抑制炎癥并保護小鼠，使之避免死于致命的內毒素休克。可見，LBP和CD介導了老年感染性多器官損傷。

TLR是近幾年發現的一類天然免疫受體，其分布十分廣泛，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、多形核細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞等表面，屬于模式識別受體，可對病原體相關分子模式進行識別、結合，并引發一系列信號轉導，進而導致炎性介質的釋放，在天然免疫防御中起著重要作用，并最終激活獲得性免疫系統〔8，9〕。目前，TLR家族成員至少有11個(TLR1～TLR11)，其中LPS引起的組織損傷主要有TLR4介導，國外有不少學者認為許多疾病與TLR4有著密切關系。本實驗結果表明肺、心、小腸組織TLR4表達老齡、青年模型組表達較對照組明顯增強，提示TLR4參與了感染性多器官損傷。既往研究顯示LPS引起急性肺損傷時，肺巨噬細胞TLR4 mRNA表達明顯增強，腫瘤壞死因子(TNF-α)分泌增多，說明TLR4參與肺組織炎癥反應，其機制可能是通過增加TLR4的表達而使TNF-α等炎癥因子分泌增多所致。G－菌LPS性休克在感染性休克中大致占50%，在對G－菌及其產物的識別中，TLR4起著非常重要的作用。當TLR4與配體結合后，激活NF-κB并上調TNF等細胞因子的表達，增強機體的炎性反應，達到殺傷病原體的目的。但是過強的炎性反應將加重組織器官的損害，嚴重時產生全身炎癥反應綜合征(SIRS)，最終導致G－菌LPS性休克〔10〕。Ruemmele等〔11〕報道腸上皮細胞在 TLR4調節下分泌內源性TNF，引起腸炎。可見，TLR4參與了老年感染性多器官損傷，并在其中發揮了非常重要的作用。實驗結果還表明，老齡模型肺、心、小腸組織TLR4蛋白表達較青年模型明顯增強，這可能是導致老年臟器損傷較青年重的機制之一。由于TLR4表達較強，其激活NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)更明顯，結果導致更多炎性因子和炎癥介質分泌，引起組織損傷。

最近研究表明，IRAK-1在IL-1信號轉導中起重要的調控作用，這種早期信號分子為白細胞介素(IL-1)活化NF-κB所必需〔12〕。TRAF6是多種生理過程的信號調節分子，先天性和獲得性免疫、骨代謝、淋巴結發育、乳腺發育甚至皮膚和中樞神經系統的發育無不與TRAF6密不可分。作為接頭分子，激活NF-κB和JNK〔13〕。本研究顯示肺、心、小腸組織模型組IRAK-1和TRAF6 mRNA表達較對照組明顯增強，老齡心組織表達較青年更為顯著，提示IRAK-1和TRAF6作為TLR下游分子參與了老年多臟器損傷的病理生理過程。

NF-κB 通過調控編碼細胞因子 (如 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α)、黏附分子、急性期蛋白和多種酶類(如誘導型一氧化氮合成酶、環氧化酶)基因的表達，進而參與炎癥反應放大和延續，在膿毒癥的發生過程中起非常關鍵作用〔14，15〕。臨床觀察顯示，術后發生MODS患者中性粒細胞NF-κB活性顯著增高。實驗研究用NF-κB抑制劑能顯著抑制膿毒性休克大鼠肺組織一氧化氮合酶基因表達，并呈劑量依賴性;同時可明顯減輕LPS引起的動脈血壓下降，表明NF-κB活化參與了機體失控性炎癥反應與器官損害的病理生理過程〔16〕。本實驗結果顯示肺、心、小腸組織模型組NF-κB表達較對照組明顯增高，說明NF-κB參與細菌性肺炎所致之多器官損傷，并發揮了重要作用。由于老齡大鼠臟器組織NF-κB的活性較青年增高顯著，可能導致更多的炎癥因子和炎癥介質合成和釋放，結果臟器損傷老年較青年為重。當然，老年臟器損傷重，亦可能與增齡因素有關。

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