Cox-2啟動子在人腦膠質瘤細胞中的特異性啟動

白利民 申 強 (吉林省人民醫院，吉林 長春 130021)

條件復制型腺病毒又稱腫瘤特異性增殖型腺病毒，目前最廣泛地應用于腫瘤的基因治療。腫瘤與正常細胞組織因基因結構上的差異，出現了包括代謝、增生、生長等多方面的明顯差異。腫瘤細胞復制過程中可以大量分泌出正常細胞無法分泌或者少分泌的物質，條件復制型腺病毒可以利用這些物質對病毒產生特異的靶向性，可在腫瘤細胞內復制增生，達到目的基因蛋白表達，最終殺死腫瘤細胞。鑒于良好的啟動活性和腫瘤特異性，Cox-2等啟動子越來越成為基因治療中研究的熱點與重點〔1～7〕，并已構建Cox-2啟動子攜帶E1A的條件復制性腺病毒 (Ad-Cox-2-E1A)〔8〕。本文通過熒光素酶報告基因原理，檢測Cox-2啟動子在實驗細胞中的啟動活性。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光素酶檢測試劑，RNeasy Mini kit，RNase inhibitor，Adeno-XTM Expression System，MTT 試劑盒，病毒基因組提取試劑盒，RNA提取試劑盒，DMEM medium，HEK293細胞組，anti-Cox-2抗體，anti-E1A抗體，Western印跡試劑等。

1.2 方法

1.2.1 重組條件復制性腺病毒的獲得

1.2.1.1 重組腺病毒質粒的構建及鑒定 本實驗所用的腺病毒載體為人血清5型腺病毒，重組腺病毒質粒Ad-Cox-2-E1A經酶切和測序鑒定。PCR Cox-2 promoter的模板為Hela細胞基因組，引物為:同義引物:5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAGGTACCTGGTGTAGTTTTA-3'，反義引物:5'-GAATTCGCTAGCCGCTGCTGAGGAGTTCC-3'。PCR E1的模板為HEK293細胞基因組，引物為:E1-1同義引物:5'-CCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCAC-3'，E1-1，反義引物:5'-GTATTCCTCCGGTGATAAT-3';E1-2同義引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反義引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3';E1-3同義引物:5'-GTACCTGCTGGATTTTCTG-3'，反義引物:5'-ACCCATAGAAGCTTACACC-3';E1-4同義引物:5'-GGTGTAAGCTTCTATGGGT-3'，反義引物:5'-CCGGAATTCGTCGACGCTGCTGCAAAACAG ATA C-3'。

1.2.1.2 重組腺病毒的鑒定 PCR法鑒定:用病毒基因組提取試劑盒提取病毒基因組，PCR腺病毒基因組E2b特異性片段鑒定腺病毒。同義引物:5'-tcgtttctcagcagctgttg-3'，反義引物:5'-catctgaactcaaagcgtgg-3'。PCR E1基因鑒定外源基因，同義引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反義引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3'。

Western印跡鑒定E1蛋白表達:SDS-PAGE電泳分離，轉膜，洗膜，顯色，漂洗。(具體操作參照《分子克隆實驗指南》)。采用的抗腺病毒E1A一抗為本實驗室自制多克隆兔血清。

1.2.2 熒光素酶表達的檢測 在6孔板中，將Ade-Cox-2-luciferase 或 Ade-CMV-luciferase 3 μg 用 lipo2000 8 μl轉染實驗細胞，設Ad-Blank(非復制性5型腺病毒)為陰性對照，CMV(巨細胞病毒)為陽性對照，用裂解緩沖液在板中裂解細胞，晃動培養皿數次以保證裂解緩沖液完全覆蓋細胞。將細胞從培養皿刮下，將細胞及所有的液體轉移至離心管中，置于冰上，旋渦震蕩離心管5～10 s，12 000 r/min離心15 s(室溫)。將上清液轉移至一個新的試管中。將100 μl熒光素酶檢測試劑加入熒光光度計試管中，每管一個樣品。將熒光光度計的程序設置為:2 s延遲及10 s熒光素酶活性測量讀數。將20 μl細胞裂解液加入裝有熒光素酶檢測試劑的熒光光度計試管中，吹打或輕微旋渦震蕩以混合，上機檢測并記錄讀數。

2 結果

2.1 重組腺病毒質粒的構建 按照腺病毒質粒構建流程圖構建重組腺病毒質粒Ad-Cox-2-E1，I-Ceu I/PI-SceI雙酶切質粒Ad-Cox-2-E1，電泳約4 500 bp及32 000 bp處有點，得陽性克隆。見圖1。

2.2 按照腺病毒質粒構建流程圖構建重組腺病毒質粒 ICeu I/PI-SceI雙酶切質粒Ad-Cox-2-luciferase，電泳約4 000 bp及32 000 bp處有點，得陽性克隆。I-Ceu I/PI-SceI雙酶切質粒Ad-CMV-luciferase，電泳約3 300 bp及32 000 bp處有點，得陽性克隆。見圖2。

2.3 重組腺病毒的鑒定 Ad-Cox2-E1在基因水平有特異性E1基因，大小約為3 000 bp，特異性E2b基因，大小為860 bp;在蛋白水平，Ad-Cox2-E1感染細胞均有特異性E1A蛋白表達，大小約為45 kD。說明在包裝擴增純化過程中，重組腺病毒片段沒有丟失，外源基因表達正常。見圖3。

2.4 Ad-CMV-luciferase或Ad-Cox-2-luciferase感染實驗細胞，檢測luciferase表達 見圖4。

圖1 質粒Ad-Cox-2-E1的鑒定

圖2 質粒Ad-Cox-2-luciferase和Ad-CMV-luciferase的構建

圖3 腺病毒Ad-Cox-2-E1的檢測

圖4 Luciferase的活性檢測

近年來研究表明Cox-2在腦膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中表達上調，參與腫瘤的發生發展和轉移〔1～4〕，并參與腫瘤新生血管的形成，而在大多數正常組織中不表達〔5〕。作為一種新的腫瘤特異性啟動子，人們對COX-2啟動子進行了廣泛的研究，并且其在腦膠質瘤、胃腸癌、食道癌〔6，7〕的基因治療研究中表現出很好的治療前景。

條件復制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)是針對腺病毒本身無明顯特異性復制表達的缺點而構建出來的病毒，它具有的特異性復制能力及腺病毒本身固有的生物特性，放大了腫瘤治療作用和溶瘤作用〔9〕?，F今，條件復制型腺病毒越來越受到人們的重視，并對其開展了廣泛深入的研究。條件復制型腺病毒與傳統的復制缺陷腺病毒比較有以下優點:①病毒可以在腫瘤細胞內大量增殖，直接導致被感染的腫瘤細胞裂解，裂解擴散的病毒可以繼續感染鄰近腫瘤細胞;②腺病毒基因表達的過程中釋放大量的腫瘤抗原蛋白，傳遞給樹突細胞和T細胞識別，起到了免疫放大效果，加強了腫瘤免疫反應;③條件復制型腺病毒自身體積變小，可容量明顯變大，所以可攜帶較大片段的外源性治療基因，即它在腫瘤細胞內復制的同時還通過攜帶治療基因達到殺滅腫瘤的效果，這也打下了多途徑多方法聯合應用的基礎。從理論上講，在腫瘤基因治療中，條件復制性腺病毒及攜帶的抗癌活性基因只要腫瘤細胞存在，抗癌活性基因就會繼續表達，直至殺死全部的腫瘤細胞為止。這與因藥物半衰期而療效減退的常規治療大不相同，所以條件復制性腺病毒在腫瘤治療中表現出了良好的治療持續性。

熒光素酶報告基因〔10〕是把熒光素酶基因的編碼序列和基因表達調節序列融合形成嵌合基因，或與其他目的基因融合，在調控序列控制下進行表達，通過熒光素酶生物發光特性，利用閃爍計數器對熒光素酶的活性作出定量定性檢測來標定目的基因的表達狀況。熒光素酶有以下優點:靈敏度高，特異性好，應用范圍廣，無毒性。基于上述優點，本研究將熒光素酶基因插入Cox-2啟動子之后，監測Ad-Cox-2與Ad-CMV在正常細胞與腦膠質瘤細胞中表達量。Ad-Cox-2-luciferase感染正常細胞，luciferase表達的值為894±100.5，是空白組表達的1.8倍，說明Cox-2啟動子在正常細胞中基本沒有檢測到啟動活性;Ad-Cox-2-luciferase感染腦膠質瘤細胞，luciferase表達的值為10 483±765.6和12 387±1004.2，是相應空白組的27倍和30倍，說明在腦膠質瘤細胞中Cox-2啟動子具有高啟動活性，但是Cox-2啟動子在腫瘤細胞中的啟動活性稍低于CMV啟動子。以上結果可以說明，在腺病毒載體中Cox-2啟動子在正常腦成纖維細胞中不具有啟動活性，即啟動特異，其所攜帶的基因只在腫瘤細胞中特異性表達，從而達到比較好的治療作用，同時降低對于周圍細胞的副作用。

本實驗成功構建并鑒定COX-2啟動子攜帶E1A的條件復制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)，并通過熒光素酶報告基因證實了Ad-COX-2-E1A在膠質瘤細胞中的啟動特異性，可以利用其驅動治療基因特異性表達，實現腫瘤的基因治療。

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8 申 強，于 音.COX-2啟動子攜帶E1A的條件復制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)的構建及鑒定〔J〕.中國老年學雜志，2010;24(30):3736-9.

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